Prospektivní, randomizovaná studie srovnávající ICSI s inseminací u pacientů s nemužským faktorem podstupujících PGT-A

Intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI) je procedura prováděná během in vitro fertilizace (IVF), při které je jedna spermie injikována přímo do oocytu. Tento postup byl vyvinut pro mužskou neplodnost kvůli jeho požadavku na velmi malý počet životaschopných spermií. Míra oplodnění byla zaznamenána jako přibližně 60-70 %, srovnatelná s tradiční inseminací. Jeho použití se rozšířilo a nyní je doporučováno pro cykly IVF, ve kterých se provádí preimplantační genetické vyšetření na aneuploidii (PGT-A) na blastocystách. S PGT-A mohou být euploidní embrya vybrána k přenosu, což v konečném důsledku zvyšuje počet implantací, zvyšuje počet probíhajících těhotenství a snižuje výskyt potratů. Doporučení používat ICSI pro všechny cykly PGT-A bylo původně založeno na zajištění monospermické fertilizace a minimalizaci kontaminace dalšími spermiemi připojenými k zona pellucida oocytu během použití polymerázové řetězové reakce (PCR) pro genetické testování. To se však méně týká novějších sekvenačních molekulárních technik nové generace, které se nyní používají a umožňují analýzu s mnohem vyšším rozlišením.

Bylo navrženo, že ICSI může mírně zvýšit riziko poruch otisku a vrozených vad a významně zvyšuje náklady na IVF. Meióza II nastává během oplodnění oocytu a jako taková by jakékoli narušení meiózního aparátu mohlo potenciálně vést k chybám v dělení chromozomů. Předpokládáme, že postup ICSI může interferovat s normálním procesem meiózy a vést k vyššímu výskytu aneuploidních blastocyst.

Naše studie náhodně přiřadí pacienty s neplodností jiného než mužského původu podstupující IVF s PGT-A v Texas Fertility Center buď ke konvenční inseminaci nebo ICSI. Budou zahrnuty ženy ve věku 18-39 let s alespoň 10 oocyty po odběru. Počáteční analýza spermatu musí mít větší nebo rovnou 16 milionům spermií/ml, 42 % pohyblivých spermií, 16,4 milionu celkových pohyblivých spermií, 30 % progresivní pohyblivosti a 4 % normální morfologie (jak je definováno v 6. vydání WHO). Pacientky budou vyloučeny pro kterýkoli z následujících případů: jakékoli selhání oplodnění nebo více než jedno selhání implantace z předchozích cyklů IVF; neplodnost mužského faktoru definovaná koncentrací spermií menší než 16 milionů spermií/ml, pohyblivostí menší než 42 %, celkovým počtem pohyblivých buněk menším než 16,4 milionů, progresivní pohyblivostí menší než 30 % a normální morfologií menší než 4 %; partnerka starší 39 let; 9 nebo méně oocytů po odběru; páry vyžadující analýzu jednoho genu pomocí preimplantačního genetického testování na monogenní poruchy (PGT-M); ICSI z jakéhokoli jiného důvodu než PGT-A.

Partnerka podstoupí řízenou ovariální stimulaci s protokolem zvoleným lékařem každé pacientky na základě věku pacientky, anamnézy a ovariální rezervy. Ke stimulaci bude použit rekombinantní folikuly stimulující hormon (FSH) (Gonal F nebo Follistim) a lidský menopauzální gonadotropin (Menopur). K potlačení ovulace bude použit agonista hormonu uvolňujícího gonadotropin (GnRH) (Lupron) nebo antagonista (Cetrotide nebo Ganirelix) s orálními antikoncepčními pilulkami (OCP) nebo bez nich nebo s estradiolem. Pacientka bude sledována každé 1-3 dny pomocí ultrazvuku k měření růstu folikulů a také hladiny estradiolu v krvi, přičemž podle toho se upraví medikace a dávkování. Zrání oocytů bude spuštěno agonistou hormonu uvolňujícího gonadotropin (GnRH) (Lupron) a/nebo lidským choriovým gonadotropinem (Novarel nebo Pregnyl). K odběru oocytů dojde 36 hodin po spuštění podle standardních protokolů v našem centru.

Oocyty budou promyty víceúčelovým manipulačním médiem (MHM) plus 0,5% lidský sérový albumin (HSA). Přebytečné kupovité buňky a krev budou oříznuty. Oocyty budou přeneseny do misky obsahující Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium se dvěma oocyty na misku. Miska bude poté přenesena do inkubátoru.

Oocyty určené pro ICSI budou okamžitě vystaveny hyaluronidáze, aby se odstranily kumuly a koronální buňky. Embryologové posoudí stav zrání pod inverzní mikroskopií. ICSI bude provedeno na všech zralých oocytech metafáze II 4 hodiny po odběru. Injikované oocyty se poté umístí do čerstvé kultivační misky a vrátí se do inkubátoru.

U oocytů určených pro konvenční inseminaci dojde k inseminaci 4-6 hodin po odběru. Spermie budou odebrány jako čerstvý vzorek a promyty Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. Koncentrace a pohyblivost spermií budou hodnoceny před a po promytí podle kritérií WHO 6. vydání. Spermie budou připraveny tak, aby bylo dosaženo koncentrace 200 000 spermií na 100 mikrolitrovou kapku. Do každé misky se přidá 6 kapek připraveného spermatu.

Následující ráno po ICSI nebo konvenční inseminaci (den 1) budou oocyty vyšetřeny na oplodnění. Zygoty se dvěma pronukley (2PN) budou uchovávány ve skupinové kultuře, aby byly znovu hodnoceny 5., 6. a 7. den. Embrya, která dosáhnou stadia blastocysty, budou našimi embryology morfologicky klasifikována. Vnitřní buněčná hmota (ICM) a trofektoderm budou mít každý stupeň dobrý (G), slušný (F) nebo špatný (P). Blastocysty stupně G nebo F podstoupí biopsii trofektodermu a následnou vitrifikaci. Biopsie trophektodermu bude provedena pomocí standardního protokolu: Líhnoucí se trofoblastové buňky naproti vnitřní buněčné hmotě budou jemně odsáty do bioptické pipety. Laser SaturnActive bude použit k oddělení 3-5 buněk. Bioptické buňky budou připraveny a vloženy do PCR zkumavek podle protokolů centra PGT-A a skladovány při -20 stupních Celsia až do transportu do testovacího centra.

Next Generation Sequencing bude použit k analýze vzorků v testovacím centru PGT (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI nebo Genomic Prediction). Variace počtu kopií budou použity k diagnostice stavu ploidie. Euploidie bude definována jako normální počet chromozomů. Aneuploidie bude definována jako abnormální počet chromozomů. Mozaicismus bude definován jako 30-70% mozaika, zatímco méně než 30% mozaika bude považováno za euploidii a více než 70% mozaika bude považováno za aneuploidii. Výsledky PGT-A budou analyzovány na procento euploidních, aneuploidních, mozaikových a bezvýsledných embryí.