Tuleva, satunnaistettu tutkimus, jossa verrataan ICSI:tä inseminaatioon potilailla, jotka eivät ole miespuolisia, joille tehdään PGT-A

Intrasytoplasminen siittiöiden injektio (ICSI) on toimenpide, joka suoritetaan koeputkihedelmöityksen (IVF) aikana, jossa yksi siittiö injektoidaan suoraan munasoluun. Tämä menetelmä kehitettiin miesten hedelmättömyyteen, koska se vaatii hyvin pientä määrää elinkelpoisia siittiöitä. Lannoitusasteiden on todettu olevan noin 60-70 %, mikä on verrattavissa perinteiseen siemennykseen. Sen käyttö on laajentunut ja sitä suositellaan nyt IVF-sykleihin, joissa blastokysteille suoritetaan preimplantaatiogeeninen aneuploidioiden (PGT-A) testaus. PGT-A:n avulla voidaan valita siirrettäviä euploidisia alkioita, mikä lisää lopulta implantaatioiden määrää, lisää jatkuvaa raskautta ja vähentää keskenmenojen ilmaantuvuutta. Suositus käyttää ICSI:tä kaikissa PGT-A-sykleissä perustui alun perin monospermisen hedelmöittymisen varmistamiseen ja munasolun zona pellucidaan kiinnittyneiden lisäsiittiöiden aiheuttaman kontaminaation minimoimiseen polymeraasiketjureaktion (PCR) käytön aikana geneettiseen testaukseen. Tämä on kuitenkin vähemmän huolestuttava uudemmissa seuraavan sukupolven sekvensointimolekyylitekniikoissa, joita käytetään nyt ja jotka mahdollistavat paljon korkeamman resoluution analyysin.

On ehdotettu, että ICSI saattaa hieman lisätä imprinting-häiriöiden ja synnynnäisten epämuodostumien riskiä ja nostaa merkittävästi IVF:n kustannuksia. Meioosi II esiintyy oosyyttihedelmöityksen aikana, ja sellaisenaan mikä tahansa meioosilaitteiston häiriö saattaa johtaa virheisiin kromosomien jakautumisessa. Oletamme, että ICSI-menettely voi häiritä normaalia meioosiprosessia ja johtaa aneuploidisten blastokystien lisääntymiseen.

Tutkimuksemme määrää satunnaisesti potilaat, joilla ei ole miestekijän hedelmättömyyttä ja joille tehdään IVF PGT-A:lla Texasin hedelmällisyyskeskuksessa joko tavanomaiseen keinosiemennykseen tai ICSI:hen. Mukaan otetaan 18–39-vuotiaat naiset, joilla on vähintään 10 munasolua noudon jälkeen. Ensimmäisessä siemennesteanalyysissä on oltava vähintään 16 miljoonaa siittiötä/ml, liikkuvia siittiöitä 42 %, liikkuvia siittiöitä yhteensä 16,4 miljoonaa, liikkuvuutta 30 % ja normaalia morfologiaa 4 % (WHO:n 6. painoksen määritelmän mukaan). Potilaat suljetaan pois seuraavista syistä: mikä tahansa hedelmöityshäiriö tai useampi kuin yksi implantaatiohäiriö edellisistä IVF-jaksoista; miehen tekijän hedelmättömyys, joka määritellään siittiöiden konsentraatiolla alle 16 miljoonaa siittiötä/ml, liikkuvuudesta alle 42 %, kokonaisliikkuvuus alle 16,4 miljoonaa, progressiivinen liikkuvuus alle 30 % ja normaali morfologia alle 4 %; yli 39-vuotias naiskumppani; 9 tai vähemmän munasolua talteenoton jälkeen; parit, jotka vaativat yhden geenin analyysin preimplantaatiogeenitestillä monogeenisten häiriöiden (PGT-M) varalta; ICSI mistä tahansa muusta syystä kuin PGT-A.

Naispuoliselle kumppanille suoritetaan kontrolloitu munasarjojen stimulaatio protokollalla, jonka kunkin potilaan lääkäri valitsee potilaan iän, historian ja munasarjavarannon perusteella. Stimulaatioon käytetään rekombinanttia follikkelia stimuloivaa hormonia (FSH) (Gonal F tai Follistim) ja ihmisen menopausaalista gonadotropiinia (Menopur). Ovulaation estämiseen käytetään gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) agonistia (Lupron) tai antagonistia (Cetrotide tai Ganirelix) oraalisten ehkäisypillereiden (OCP) kanssa tai ilman tai estradiolilla. Potilasta seurataan 1-3 päivän välein ultraäänellä, jolla mitataan follikkelien kasvua sekä veren estradiolitasoja, lääkitystä ja annostusta säädetään vastaavasti. Munasolujen kypsyminen laukaistaan ​​gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) agonistilla (Lupron) ja/tai ihmisen koriongonadotropiinilla (Novarel tai Pregnyl). Oosyyttien haku tapahtuu 36 tunnin kuluttua laukaisusta keskuksessamme olevien standardiprotokollien mukaisesti.

Munasolut pestään monikäyttöisellä käsittelyväliaineella (MHM) plus 0,5 % ihmisen seerumialbumiinilla (HSA). Ylimääräiset cumulus-solut ja veri leikataan. Oosyytit siirretään maljalle, joka sisältää Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete -alustan, jossa on kaksi munasolua maljaa kohti. Tämän jälkeen astia siirretään inkubaattoriin.

ICSI:lle nimetyt munasolut altistetaan välittömästi hyaluronidaasille kumuluksen ja sepelvaltimosolujen poistamiseksi. Embryologit arvioivat kypsymistilan käänteismikroskopialla. ICSI suoritetaan kaikille kypsille metafaasi II -oosyyteille 4 tuntia talteenoton jälkeen. Injektoidut munasolut asetetaan sitten tuoreeseen viljelymaljaan ja palautetaan inkubaattoriin.

Tavanomaiseen inseminaatioon tarkoitettujen munasolujen siemennys tapahtuu 4-6 tuntia talteenoton jälkeen. Siittiöt kerätään tuoreena näytteenä ja pestään Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX:llä. Siittiöiden pitoisuus ja liikkuvuus arvioidaan ennen pesua ja sen jälkeen WHO:n kuudennen painoksen kriteerien mukaisesti. Siittiöt valmistetaan saavuttamaan pitoisuus 200 000 siittiötä 100 mikrolitran tippaa kohti. Jokaiseen astiaan lisätään 6 tippaa valmistettua siittiötä.

Seuraavana aamuna ICSI:n tai tavanomaisen inseminoinnin jälkeen (päivä 1) munasolut tutkitaan hedelmöittymisen varalta. Tsygootteja, joissa on kaksi esitumaa (2PN), pidetään ryhmäviljelmässä arvioimiseksi uudelleen päivinä 5, 6 ja 7. Alkiot, jotka saavuttavat blastokystivaiheen, arvioivat morfologisesti sikiölääkärimme. Inner Cell Mass (ICM) ja trofektodermi saavat arvosanan Hyvä (G), Kohtuullinen (F) tai Huono (P). Blastokystat, joilla on luokka G tai F, läpikäyvät trofektodermibiopsian ja sen jälkeen lasittamisen. Trophektodermibiopsia suoritetaan käyttämällä standardiprotokollaa: Kuoriutuvat trofoblastisolut vastapäätä sisäistä solumassaa aspiroidaan varovasti biopsiapipettiin. SaturnActive-laseria käytetään erottamaan 3-5 solua. Biopsioidut solut valmistetaan ja ladataan PCR-putkiin PGT-A-keskuksen protokollien mukaisesti ja niitä säilytetään -20 celsiusasteessa testikeskukseen kuljetukseen asti.

Seuraavan sukupolven sekvensointia käytetään näytteiden analysointiin PGT-testauskeskuksessa (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI tai Genomic Prediction). Kopioiden lukumäärän muunnelmia käytetään ploidisuuden tilan diagnosoimiseen. Euploidia määritellään normaaliksi kromosomien lukumääräksi. Aneuploidia määritellään epänormaaliksi lukumääräksi kromosomeja. Mosaiikki määritellään 30-70 % mosaiikkiksi, kun taas alle 30 % mosaiikki katsotaan euploidiseksi ja yli 70 % mosaiikki katsotaan aneuploidiseksi. PGT-A-tulokset analysoidaan euploidisten, aneuploidien, mosaiikkialkioiden ja tuloksettomien alkioiden prosenttiosuuden suhteen.