Проспективное рандомизированное исследование, сравнивающее ИКСИ с инсеминацией у пациентов с не-мужским фактором, проходящих PGT-A

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоидов (ИКСИ) — это процедура, выполняемая во время экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при которой один сперматозоид вводится непосредственно в ооцит. Эта процедура была разработана для лечения мужского бесплодия из-за необходимости очень небольшого количества жизнеспособных сперматозоидов. Было отмечено, что уровень оплодотворения составляет примерно 60-70%, что сравнимо с традиционным осеменением. Его использование расширилось, и в настоящее время он рекомендуется для циклов ЭКО, в которых преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (PGT-A) проводится на бластоцистах. С помощью PGT-A можно выбирать эуплоидные эмбрионы для переноса, что в конечном итоге увеличивает частоту имплантации, повышает частоту продолжающихся беременностей и снижает частоту выкидышей. Рекомендация использовать ИКСИ для всех циклов PGT-A изначально была основана на обеспечении моноспермального оплодотворения и минимизации загрязнения дополнительными сперматозоидами, прикрепленными к блестящей оболочке ооцита, во время использования полимеразной цепной реакции (ПЦР) для генетического тестирования. Однако это менее важно для более новых молекулярных методов секвенирования следующего поколения, которые теперь используются и позволяют проводить анализ с гораздо более высоким разрешением.

Было высказано предположение, что ИКСИ может немного увеличить риск нарушений импринтинга и врожденных дефектов, а также значительно увеличить стоимость ЭКО. Мейоз II происходит во время оплодотворения ооцитов, и поэтому любое нарушение аппарата мейоза потенциально может привести к ошибкам в хромосомном делении. Мы предполагаем, что процедура ИКСИ может мешать нормальному процессу мейоза и приводить к более высокому уровню анеуплоидных бластоцист.

В нашем исследовании пациенты с бесплодием не по мужскому фактору, проходящие ЭКО с PGT-A в Техасском центре фертильности, будут случайным образом распределены либо на обычную инсеминацию, либо на ИКСИ. Будут включены женщины в возрасте 18–39 лет, имеющие не менее 10 ооцитов после извлечения. Первоначальный анализ спермы должен иметь не менее 16 миллионов сперматозоидов/мл, 42 % подвижных сперматозоидов, 16,4 миллиона подвижных сперматозоидов в целом, 30 % прогрессивной подвижности и 4 % нормальной морфологии (согласно определению ВОЗ, 6-е издание). Пациенты будут исключены из-за любого из следующего: любая неудача оплодотворения или более чем одна неудача имплантации из предыдущих циклов ЭКО; бесплодие по мужскому фактору, определяемое концентрацией сперматозоидов менее 16 миллионов сперматозоидов/мл, подвижностью менее 42%, общим числом подвижных клеток менее 16,4 миллионов, прогрессивной подвижностью менее 30% и нормальной морфологией менее 4%; партнерша старше 39 лет; 9 или менее ооцитов после извлечения; парам, которым требуется анализ одного гена с помощью преимплантационного генетического тестирования на моногенные нарушения (PGT-M); ИКСИ по любой причине, кроме PGT-A.

Женщине-партнерше будет проведена контролируемая стимуляция яичников по протоколу, выбранному лечащим врачом каждой пациентки в зависимости от возраста пациентки, анамнеза и овариального резерва. Для стимуляции будут использоваться рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) (Гонал Ф или Фоллистим) и человеческий менопаузальный гонадотропин (Менопур). Агонист гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH) (Lupron) или антагонист (Cetrotide или Ganirelix) с или без оральных контрацептивов (OCP) или с праймированием эстрадиолом будет использоваться для подавления овуляции. Пациент будет контролироваться каждые 1-3 дня с использованием ультразвука для измерения роста фолликулов, а также уровня эстрадиола в крови, при этом лекарства и дозировка корректируются соответствующим образом. Созревание ооцитов будет вызвано агонистом гонадотропин-высвобождающего гормона (GnRH) (Lupron) и/или хорионическим гонадотропином человека (Novarel или Pregnyl). Извлечение ооцитов будет происходить через 36 часов после запуска в соответствии со стандартными протоколами в нашем центре.

Ооциты промывают многоцелевой средой для обработки (MHM) с добавлением 0,5% альбумина сыворотки человека (HSA). Лишние клетки кумулюса и кровь будут обрезаны. Ооциты будут перенесены в чашку, содержащую полную среду Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium, по два ооцита на чашку. Затем блюдо будет передано в инкубатор.

Ооциты, предназначенные для ИКСИ, будут немедленно подвергнуты воздействию гиалуронидазы для удаления кумулюсных и корональных клеток. Эмбриологи оценят статус созревания под инвертированной микроскопией. ИКСИ будет проводиться на всех зрелых ооцитах метафазы II через 4 часа после извлечения. Затем инъецированные ооциты помещают в чашку со свежими культурами и возвращают в инкубатор.

Для ооцитов, предназначенных для обычного осеменения, осеменение будет происходить через 4-6 часов после извлечения. Сперму собирают в виде свежего образца и промывают Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. Концентрация и подвижность сперматозоидов будут оцениваться до и после промывания в соответствии с критериями 6-го издания ВОЗ. Сперма будет подготовлена ​​для достижения концентрации 200 000 сперматозоидов на 100 мкл капли. В каждую чашку будет добавлено 6 капель подготовленной спермы.

На следующее утро после ИКСИ или обычного осеменения (день 1) ооциты проверяют на предмет оплодотворения. Зиготы с двумя пронуклеусами (2PN) будут храниться в групповой культуре для повторной оценки на 5, 6 и 7 дни. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, будут морфологически классифицированы нашими эмбриологами. Внутренней клеточной массе (ICM) и трофэктодерме будет присвоена оценка «хорошо» (G), «удовлетворительно» (F) или «плохо» (P). Бластоцисты со степенью G или F подвергаются биопсии трофэктодермы и последующей витрификации. Биопсия трофэктодермы будет проводиться с использованием стандартного протокола: вылупившиеся клетки трофобласта напротив внутренней клеточной массы будут осторожно аспирированы в пипетку для биопсии. Лазер SaturnActive будет использоваться для разделения 3-5 клеток. Клетки биопсии будут подготовлены и загружены в пробирки для ПЦР в соответствии с протоколами центра PGT-A и будут храниться при температуре -20 градусов по Цельсию до транспортировки в центр тестирования.

Секвенирование следующего поколения будет использоваться для анализа образцов в центре тестирования PGT (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI или Genomic Prediction). Варианты числа копий будут использоваться для диагностики статуса плоидности. Эуплоидия будет определяться как нормальное число хромосом. Анеуплоидия определяется как аномальное число хромосом. Мозаицизм будет определяться как мозаицизм 30-70%, тогда как мозаицизм менее 30% будет считаться эуплоидией, а мозаицизм более 70% будет считаться анеуплоидией. Результаты PGT-A будут проанализированы на процент эуплоидных, анеуплоидных, мозаичных эмбрионов и эмбрионов без результатов.