Prospektive, randomisierte Studie zum Vergleich von ICSI mit Insemination bei Patienten mit nicht männlichem Faktor, die sich einer PGT-A unterziehen

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) ist ein Verfahren, das während der In-vitro-Fertilisation (IVF) durchgeführt wird, bei der ein einzelnes Spermium direkt in eine Eizelle injiziert wird. Dieses Verfahren wurde für männliche Unfruchtbarkeit entwickelt, da nur eine sehr kleine Anzahl lebensfähiger Spermien benötigt wird. Es wurde festgestellt, dass die Befruchtungsraten etwa 60-70% betragen, vergleichbar mit der traditionellen Befruchtung. Seine Verwendung hat sich ausgeweitet und wird jetzt für IVF-Zyklen empfohlen, in denen genetische Präimplantationstests auf Aneuploidien (PGT-A) an Blastozysten durchgeführt werden. Mit PGT-A können euploide Embryonen für den Transfer ausgewählt werden, was letztendlich die Implantationsrate erhöht, die Rate der laufenden Schwangerschaften erhöht und die Häufigkeit von Fehlgeburten verringert. Die Empfehlung, ICSI für alle PGT-A-Zyklen zu verwenden, basierte ursprünglich auf der Gewährleistung einer monospermischen Befruchtung und der Minimierung der Kontamination durch zusätzliche Spermien, die während der Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für genetische Tests an der Zona pellucida der Eizelle anhaften. Dies ist jedoch weniger besorgniserregend bei neueren molekularen Sequenzierungstechniken der nächsten Generation, die jetzt verwendet werden und eine Analyse mit viel höherer Auflösung ermöglichen.

Es wurde vermutet, dass ICSI das Risiko von Prägungsstörungen und Geburtsfehlern leicht erhöhen und die Kosten der IVF erheblich erhöhen kann. Meiose II tritt während der Befruchtung der Eizelle auf, und daher könnte jede Störung des Meioseapparats möglicherweise zu Fehlern bei der Chromosomenteilung führen. Wir vermuten, dass das ICSI-Verfahren den normalen Meioseprozess stören und zu einer höheren Rate an aneuploiden Blastozysten führen kann.

Unsere Studie wird Patienten mit nicht-männlicher Unfruchtbarkeit, die sich einer IVF mit PGT-A im Texas Fertility Center unterziehen, nach dem Zufallsprinzip entweder einer konventionellen Insemination oder einer ICSI zuordnen. Frauen im Alter von 18 bis 39 Jahren mit mindestens 10 Eizellen nach der Entnahme werden eingeschlossen. Die anfängliche Samenanalyse muss mindestens 16 Millionen Spermien/ml, 42 % bewegliche Spermien, 16,4 Millionen insgesamt bewegliche Spermien, 30 % progressive Beweglichkeit und 4 % normale Morphologie aufweisen (wie in der 6. Ausgabe der WHO definiert). Patienten werden aus folgenden Gründen ausgeschlossen: jegliches Fertilisationsversagen oder mehr als ein Implantationsversagen aus früheren IVF-Zyklen; männliche Unfruchtbarkeit, definiert durch Spermienkonzentration von weniger als 16 Millionen Spermien/ml, Beweglichkeit von weniger als 42 %, Gesamtzahl der Beweglichkeit von weniger als 16,4 Millionen, progressive Beweglichkeit von weniger als 30 % und normale Morphologie von weniger als 4 %; Partnerin über 39 Jahre alt; 9 oder weniger Eizellen nach Entnahme; Paare, die eine Einzelgenanalyse durch genetische Präimplantationstests auf monogenetische Störungen (PGT-M) benötigen; ICSI aus irgendeinem anderen Grund als PGT-A.

Die Partnerin wird einer kontrollierten ovariellen Stimulation mit einem Protokoll unterzogen, das vom Arzt jeder Patientin basierend auf Alter, Vorgeschichte und ovarieller Reserve der Patientin ausgewählt wird. Zur Stimulation werden rekombinantes follikelstimulierendes Hormon (FSH) (Gonal F oder Follistim) und humanes menopausales Gonadotropin (Menopur) verwendet. Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Agonist (Lupron) oder -Antagonist (Cetrotide oder Ganirelix) mit oder ohne orale Kontrazeptiva (OCPs) oder mit Estradiol-Priming wird zur Unterdrückung des Eisprungs verwendet. Der Patient wird alle 1-3 Tage mit Ultraschall überwacht, um das Follikelwachstum sowie den Östradiolspiegel im Blut zu messen, wobei die Medikation und Dosierung entsprechend angepasst werden. Die Oozytenreifung wird mit Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH)-Agonisten (Lupron) und/oder humanem Choriongonadotropin (Novarel oder Pregnyl) ausgelöst. Die Oozytenentnahme erfolgt 36 Stunden nach dem Auslösen gemäß den Standardprotokollen in unserem Zentrum.

Oozyten werden mit Mehrzweck-Handhabungsmedium (MHM) plus 0,5 % Humanserumalbumin (HSA) gewaschen. Überschüssige Kumuluszellen und Blut werden entfernt. Oozyten werden in eine Schale mit Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium mit zwei Oozyten pro Schale überführt. Die Schale wird dann in den Inkubator überführt.

Oozyten, die für ICSI bestimmt sind, werden sofort Hyaluronidase ausgesetzt, um den Kumulus und die koronalen Zellen zu entfernen. Embryologen beurteilen den Reifungsstatus unter inverser Mikroskopie. ICSI wird an allen reifen Metaphase-II-Oozyten 4 Stunden nach der Entnahme durchgeführt. Injizierte Eizellen werden dann in eine frische Kulturschale gegeben und in den Inkubator zurückgebracht.

Bei Eizellen, die für eine konventionelle Befruchtung vorgesehen sind, erfolgt die Befruchtung 4–6 Stunden nach der Entnahme. Das Sperma wird als frische Probe entnommen und mit Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX gewaschen. Spermienkonzentration und -motilität werden vor und nach dem Waschen gemäß den Kriterien der 6. Ausgabe der WHO bewertet. Das Sperma wird aufbereitet, um eine Konzentration von 200.000 Spermien pro 100-Mikroliter-Tropfen zu erreichen. Zu jedem Gericht werden 6 Tropfen vorbereitetes Sperma hinzugefügt.

Am nächsten Morgen nach ICSI oder konventioneller Insemination (Tag 1) werden die Eizellen auf Befruchtung untersucht. Zygoten mit zwei Vorkernen (2PN) werden in Gruppenkultur gehalten, um an den Tagen 5, 6 und 7 erneut beurteilt zu werden. Embryonen, die das Blastozystenstadium erreichen, werden von unseren Embryologen morphologisch bewertet. Die innere Zellmasse (ICM) und das Trophektoderm werden jeweils mit Gut (G), Mittelmäßig (F) oder Schlecht (P) bewertet. Blastozysten mit Grad G oder F werden einer Trophektodermbiopsie und anschließender Vitrifikation unterzogen. Die Trophektodermbiopsie wird unter Verwendung eines Standardprotokolls durchgeführt: Schraffierte Trophoblastzellen gegenüber der inneren Zellmasse werden vorsichtig in die Biopsiepipette angesaugt. Der SaturnActive-Laser wird verwendet, um 3-5 Zellen zu trennen. Biopsierte Zellen werden gemäß den Protokollen des PGT-A-Zentrums aufbereitet und in PCR-Röhrchen geladen und bis zum Transport zum Testzentrum bei -20 Grad Celsius gelagert.

Next Generation Sequencing wird verwendet, um Proben in einem PGT-Testzentrum (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI oder Genomic Prediction) zu analysieren. Kopienzahlvariationen werden verwendet, um den Ploidiestatus zu diagnostizieren. Euploidie wird als eine normale Anzahl von Chromosomen definiert. Aneuploidie wird als eine abnormale Anzahl von Chromosomen definiert. Mosaik wird als 30–70 % Mosaik definiert, wobei weniger als 30 % Mosaik als Euploidie und mehr als 70 % als Aneuploidie betrachtet werden. PGT-A-Ergebnisse werden auf den Prozentsatz euploider, aneuploider, mosaikartiger und ergebnisloser Embryonen analysiert.