Prospektywne, randomizowane badanie porównujące ICSI z inseminacją u pacjentów z czynnikiem innym niż męski poddawanych PGT-A

Intracytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika (ICSI) to zabieg wykonywany podczas zapłodnienia in vitro (IVF), w którym pojedynczy plemnik jest wstrzykiwany bezpośrednio do komórki jajowej. Procedura ta została opracowana w przypadku niepłodności męskiej ze względu na zapotrzebowanie na bardzo małą liczbę żywotnych plemników. Zaobserwowano, że wskaźniki zapłodnienia wynoszą około 60-70%, co jest porównywalne z tradycyjną inseminacją. Jego zastosowanie rozszerzyło się i jest obecnie zalecane w cyklach IVF, w których przeprowadza się przedimplantacyjne testy genetyczne w kierunku aneuploidii (PGT-A) na blastocystach. Dzięki PGT-A zarodki euploidalne mogą być wybrane do przeniesienia, ostatecznie zwiększając wskaźniki implantacji, zwiększając wskaźniki trwających ciąż i zmniejszając częstość poronień. Zalecenie stosowania ICSI we wszystkich cyklach PGT-A opierało się początkowo na zapewnieniu zapłodnienia jednonasiennego i zminimalizowaniu kontaminacji dodatkowymi plemnikami przyczepionymi do osłonki przejrzystej oocytu podczas stosowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) do badań genetycznych. Ma to jednak mniejsze znaczenie w przypadku nowszych technik sekwencjonowania molekularnego nowej generacji, które są obecnie stosowane i umożliwiają analizę o znacznie wyższej rozdzielczości.

Sugeruje się, że ICSI może nieznacznie zwiększać ryzyko zaburzeń imprintingu i wad wrodzonych oraz znacznie zwiększa koszt zapłodnienia in vitro. Mejoza II występuje podczas zapłodnienia komórki jajowej i jako taka, każde zakłócenie aparatu mejozy może potencjalnie prowadzić do błędów w podziale chromosomów. Stawiamy hipotezę, że procedura ICSI może zakłócać normalny proces mejozy i prowadzić do wyższego wskaźnika aneuploidalnych blastocyst.

Nasze badanie losowo przydzieli pacjentów z niepłodnością inną niż męska poddawanych IVF z PGT-A w Texas Fertility Center do konwencjonalnej inseminacji lub ICSI. Uwzględnione zostaną kobiety w wieku 18-39 lat z co najmniej 10 komórkami jajowymi po pobraniu. Wstępna analiza nasienia musi mieć co najmniej 16 milionów plemników/ml, 42% ruchliwych plemników, 16,4 miliona wszystkich ruchliwych plemników, 30% ruchliwości progresywnej i 4% prawidłowej morfologii (zgodnie z 6. wydaniem WHO). Pacjenci zostaną wykluczeni z następujących przypadków: niepowodzenie zapłodnienia lub więcej niż jedno niepowodzenie implantacji z poprzednich cykli IVF; czynnik niepłodności męskiej, zdefiniowany jako stężenie plemników poniżej 16 milionów plemników/ml, ruchliwość poniżej 42%, całkowita liczba ruchliwości poniżej 16,4 miliona, ruchliwość postępowa poniżej 30% i prawidłowa morfologia poniżej 4%; partnerka w wieku powyżej 39 lat; 9 lub mniej oocytów po pobraniu; pary wymagające analizy pojedynczego genu za pomocą preimplantacyjnego badania genetycznego w kierunku zaburzeń monogenowych (PGT-M); ICSI z jakiegokolwiek innego powodu niż PGT-A.

Partnerka zostanie poddana kontrolowanej stymulacji jajników z protokołem wybranym przez lekarza każdej pacjentki na podstawie wieku pacjentki, historii i rezerwy jajnikowej. Do stymulacji wykorzystany zostanie rekombinowany hormon folikulotropowy (FSH) (Gonal F lub Follistim) oraz ludzka gonadotropina menopauzalna (Menopur). Agonista hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) (Lupron) lub antagonista (Cetrotide lub Ganirelix) z doustnymi pigułkami antykoncepcyjnymi (OCP) lub bez nich lub z primingiem estradiolem będzie stosowany do hamowania owulacji. Pacjent będzie monitorowany co 1-3 dni za pomocą ultradźwięków w celu pomiaru wzrostu pęcherzyków, jak również poziomu estradiolu we krwi, z odpowiednim dostosowaniem leków i dawkowania. Dojrzewanie oocytów zostanie wywołane przez agonistę hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) (Lupron) i/lub ludzką gonadotropinę kosmówkową (Novarel lub Pregnyl). Pobranie oocytów nastąpi 36 godzin po wyzwoleniu, zgodnie ze standardowymi protokołami w naszym ośrodku.

Komórki jajowe zostaną przemyte wielozadaniową pożywką do manipulacji (MHM) z dodatkiem 0,5% albuminy surowicy ludzkiej (HSA). Nadmiar komórek wzgórka i krwi zostanie odcięty. Oocyty zostaną przeniesione do szalki zawierającej kompletne podłoże Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium z dwoma oocytami na szalkę. Naczynie zostanie następnie przeniesione do inkubatora.

Oocyty przeznaczone do ICSI zostaną natychmiast wystawione na działanie hialuronidazy w celu usunięcia komórek wzgórka i korony. Embriolodzy ocenią stan dojrzewania pod mikroskopem odwróconym. ICSI zostanie przeprowadzone na wszystkich dojrzałych oocytach metafazy II 4 godziny po pobraniu. Wstrzyknięte komórki jajowe zostaną następnie umieszczone w naczyniu do świeżej hodowli i ponownie włożone do inkubatora.

W przypadku oocytów przeznaczonych do konwencjonalnej inseminacji, inseminacja nastąpi 4-6 godzin po pobraniu. Plemniki zostaną pobrane jako świeża próbka i przemyte płynem Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. Stężenie i ruchliwość plemników zostaną ocenione przed i po praniu zgodnie z kryteriami 6. edycji WHO. Plemniki zostaną przygotowane do osiągnięcia stężenia 200 000 plemników na 100 mikrolitrów kropli. Do każdego naczynia zostanie dodanych 6 kropli przygotowanej spermy.

Następnego ranka po ICSI lub konwencjonalnej inseminacji (Dzień 1) komórki jajowe zostaną zbadane pod kątem zapłodnienia. Zygoty z dwoma przedjądrzami (2PN) będą trzymane w hodowli grupowej do ponownej oceny w dniach 5, 6 i 7. Zarodki, które osiągną stadium blastocysty, zostaną ocenione morfologicznie przez naszych embriologów. Masa komórek wewnętrznych (ICM) i trofektoderma otrzymają ocenę dobrą (G), dostateczną (F) lub słabą (P). Blastocysty stopnia G lub F zostaną poddane biopsji trofektodermy, a następnie witryfikacji. Biopsja trophektodermy zostanie przeprowadzona zgodnie ze standardowym protokołem: wylęgające się komórki trofoblastu znajdujące się naprzeciw masy komórek wewnętrznych zostaną delikatnie zassane do pipety biopsyjnej. Laser SaturnActive zostanie użyty do rozdzielenia 3-5 komórek. Komórki z biopsji zostaną przygotowane i załadowane do probówek PCR zgodnie z protokołami ośrodka PGT-A i przechowywane w temperaturze -20 stopni Celsjusza do czasu transportu do ośrodka badawczego.

Sekwencjonowanie nowej generacji zostanie wykorzystane do analizy próbek w centrum testowym PGT (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI lub Genomic Prediction). Warianty liczby kopii zostaną wykorzystane do zdiagnozowania stanu ploidalności. Euploidia zostanie zdefiniowana jako normalna liczba chromosomów. Aneuploidia zostanie zdefiniowana jako nieprawidłowa liczba chromosomów. Mozaicyzm zostanie zdefiniowany jako 30-70% mozaicyzmu, podczas gdy mniej niż 30% mozaicyzmu będzie uważane za euploidię, a więcej niż 70% mozaicyzmu będzie uważane za aneuploidię. Wyniki PGT-A zostaną przeanalizowane pod kątem odsetka zarodków euploidalnych, aneuploidalnych, mozaikowych i bez wyników.