Prospectief, gerandomiseerd onderzoek waarin ICSI wordt vergeleken met inseminatie bij niet-mannelijke factorpatiënten die PGT-A ondergaan

Intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI) is een procedure die wordt uitgevoerd tijdens in-vitrofertilisatie (IVF) waarbij een enkel sperma rechtstreeks in een eicel wordt geïnjecteerd. Deze procedure is ontwikkeld voor onvruchtbaarheid bij mannelijke factoren vanwege de vereiste van een zeer klein aantal levensvatbare spermacellen. Er is vastgesteld dat de bevruchtingspercentages ongeveer 60-70% bedragen, vergelijkbaar met traditionele inseminatie. Het gebruik ervan is uitgebreid en wordt nu aanbevolen voor IVF-cycli waarbij pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdieën (PGT-A) worden uitgevoerd op blastocysten. Met PGT-A kunnen euploïde embryo's worden geselecteerd om terug te plaatsen, waardoor uiteindelijk de implantatiesnelheid wordt verhoogd, het aantal doorgaande zwangerschappen toeneemt en de incidentie van miskramen wordt verminderd. De aanbeveling om ICSI te gebruiken voor alle PGT-A-cycli was aanvankelijk gebaseerd op het waarborgen van monospermische bevruchting en het minimaliseren van besmetting door extra sperma dat aan de zona pellucida van de eicel is gehecht tijdens het gebruik van polymerasekettingreactie (PCR) voor genetische testen. Dit is echter van minder belang bij nieuwere moleculaire sequencing-technieken van de volgende generatie die nu worden gebruikt en analyses met een veel hogere resolutie mogelijk maken.

Er is gesuggereerd dat ICSI het risico op inprentingsstoornissen en geboorteafwijkingen enigszins kan verhogen, en de kosten van IVF aanzienlijk kan verhogen. Meiose II vindt plaats tijdens eicelbevruchting en als zodanig kan elke verstoring van het meiose-apparaat mogelijk leiden tot fouten in de chromosomale deling. Onze hypothese is dat de ICSI-procedure het normale meioseproces kan verstoren en kan leiden tot een hoger aantal aneuploïde blastocysten.

Onze studie zal patiënten met niet-mannelijke factoronvruchtbaarheid die IVF met PGT-A ondergaan in het Texas Fertility Center willekeurig toewijzen aan conventionele inseminatie of ICSI. Vrouwen van 18-39 jaar oud met ten minste 10 oöcyten na het ophalen zullen worden opgenomen. De initiële sperma-analyse moet groter zijn dan of gelijk zijn aan 16 miljoen spermacellen/ml, 42% beweeglijk sperma, 16,4 miljoen totaal beweeglijk sperma, 30% progressieve motiliteit en 4% normale morfologie (zoals gedefinieerd door de 6e editie van de WHO). Patiënten worden uitgesloten voor een van de volgende zaken: mislukte bevruchting of meer dan één mislukte implantatie van eerdere IVF-cycli; onvruchtbaarheid bij mannelijke factoren zoals gedefinieerd door spermaconcentratie van minder dan 16 miljoen spermacellen/ml, motiliteit van minder dan 42%, totaal aantal motiliën van minder dan 16,4 miljoen, progressieve motiliteit van minder dan 30% en normale morfologie van minder dan 4%; vrouwelijke partner ouder dan 39 jaar; 9 of minder oöcyten na verwijdering; paren die enkelvoudige genanalyse vereisen door middel van pre-implantatie genetische tests voor monogene aandoeningen (PGT-M); ICSI om een ​​andere reden dan PGT-A.

De vrouwelijke partner ondergaat gecontroleerde ovariële stimulatie met een protocol gekozen door de arts van elke patiënt op basis van de leeftijd, geschiedenis en ovariële reserve van de patiënt. Recombinant follikelstimulerend hormoon (FSH) (Gonal F of Follistim) en humaan menopauze gonadotropine (Menopur) zullen worden gebruikt voor stimulatie. Gonadotropine-releasing hormoon (GnRH) -agonist (Lupron) of antagonist (Cetrotide of Ganirelix) met of zonder orale anticonceptiepillen (OCP's) of met oestradiolpriming zal worden gebruikt voor het onderdrukken van de ovulatie. De patiënt zal elke 1-3 dagen worden gecontroleerd met behulp van echografie om de groei van de follikels en de oestradiolspiegels in het bloed te meten, waarbij medicatie en dosering dienovereenkomstig worden aangepast. De rijping van de eicel wordt geactiveerd met de gonadotropine-releasing hormone (GnRH)-agonist (Lupron) en/of humaan choriongonadotrofine (Novarel of Pregnyl). Het ophalen van eicellen vindt 36 uur na triggering plaats volgens de standaardprotocollen in ons centrum.

Eicellen worden gewassen met multipurpose handling medium (MHM) plus 0,5% humaan serumalbumine (HSA). Overtollige cumuluscellen en bloed worden weggesneden. Oöcyten worden overgebracht naar een schaal met Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium met twee oöcyten per schaal. Het gerecht wordt vervolgens overgebracht naar de incubator.

Oöcyten die bestemd zijn voor ICSI zullen onmiddellijk worden blootgesteld aan hyaluronidase om de cumulus en coronale cellen te strippen. Embryologen zullen de rijpingsstatus beoordelen onder omgekeerde microscopie. ICSI zal worden uitgevoerd op alle rijpe metafase II eicellen 4 uur na het ophalen. Geïnjecteerde eicellen worden vervolgens in een verse kweekschaal geplaatst en teruggestuurd naar de incubator.

Voor eicellen die zijn aangewezen voor conventionele inseminatie, vindt de inseminatie 4-6 uur na het ophalen plaats. Sperma wordt verzameld als een vers monster en gewassen met Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. Spermaconcentratie en -motiliteit worden voor en na het wassen beoordeeld volgens de criteria van de 6e editie van de WHO. Sperma wordt voorbereid om een ​​concentratie van 200.000 zaadcellen per druppel van 100 microliter te bereiken. Aan elk gerecht worden 6 druppels bereid sperma toegevoegd.

De volgende ochtend na ICSI of conventionele inseminatie (dag 1) worden eicellen onderzocht op bevruchting. Zygoten met twee pronuclei (2PN) worden in groepscultuur gehouden om opnieuw te worden beoordeeld op dag 5, 6 en 7. Embryo's die het blastocyststadium bereiken, zullen morfologisch worden beoordeeld door onze embryologen. De Inner Cell Mass (ICM) en het trophectoderm krijgen elk een graad van Goed (G), Redelijk (F) of Slecht (P). Blastocysten met graad G of F ondergaan een trophectodermbiopsie en daaropvolgende vitrificatie. Trophectoderm-biopsie zal worden uitgevoerd met behulp van een standaardprotocol: uitgekomen trofoblastcellen tegenover de binnenste celmassa zullen voorzichtig in de biopsiepipet worden geaspireerd. De SaturnActive-laser wordt gebruikt om 3-5 cellen te scheiden. Biopsiecellen zullen worden voorbereid en geladen in PCR-buisjes volgens de protocollen van het PGT-A-centrum en worden bewaard bij -20 graden Celsius tot ze naar het testcentrum worden vervoerd.

Next Generation Sequencing zal worden gebruikt om monsters te analyseren in een PGT-testcentrum (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI of Genomic Prediction). Kopieernummervariaties worden gebruikt om de ploïdiestatus te diagnosticeren. Euploïdie wordt gedefinieerd als een normaal aantal chromosomen. Aneuploïdie wordt gedefinieerd als een abnormaal aantal chromosomen. Mozaïcisme wordt gedefinieerd als 30-70% mozaïcisme, terwijl minder dan 30% mozaïcisme als euploïdie wordt beschouwd en meer dan 70% mozaïcisme als aneuploïdie wordt beschouwd. PGT-A-uitkomsten zullen worden geanalyseerd op het percentage euploïde, aneuploïde, mozaïek- en geen resultaat-embryo's.