Studio prospettico randomizzato di confronto tra ICSI e inseminazione per pazienti con fattore non maschile sottoposti a PGT-A

L'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI) è una procedura eseguita durante la fecondazione in vitro (IVF) in cui un singolo spermatozoo viene iniettato direttamente in un ovocita. Questa procedura è stata sviluppata per l'infertilità del fattore maschile a causa del suo fabbisogno di un numero molto ridotto di spermatozoi vitali. È stato notato che i tassi di fecondazione sono di circa il 60-70%, paragonabili all'inseminazione tradizionale. Il suo utilizzo si è ampliato ed è ora raccomandato per i cicli di fecondazione in vitro in cui viene eseguito il test genetico preimpianto per le aneuploidie (PGT-A) sulle blastocisti. Con PGT-A, gli embrioni euploidi possono essere selezionati per il trasferimento, aumentando in definitiva i tassi di impianto, aumentando i tassi di gravidanza in corso e riducendo l'incidenza di aborto spontaneo. La raccomandazione di utilizzare l'ICSI per tutti i cicli PGT-A si basava inizialmente sulla garanzia della fecondazione monospermica e sulla riduzione al minimo della contaminazione da spermatozoi aggiuntivi attaccati alla zona pellucida dell'ovocita durante l'uso della reazione a catena della polimerasi (PCR) per i test genetici. Tuttavia, questo è meno preoccupante con le nuove tecniche molecolari di sequenziamento di nuova generazione che vengono ora utilizzate e consentono analisi a risoluzione molto più elevata.

È stato suggerito che l'ICSI può aumentare leggermente il rischio di disturbi dell'imprinting e difetti congeniti e aumenta significativamente il costo della fecondazione in vitro. La meiosi II si verifica durante la fecondazione degli ovociti e, come tale, qualsiasi interruzione dell'apparato della meiosi potrebbe potenzialmente portare a errori nella divisione cromosomica. Ipotizziamo che la procedura ICSI possa interferire con il normale processo di meiosi e portare a un tasso più elevato di blastocisti aneuploidi.

Il nostro studio assegnerà in modo casuale i pazienti con infertilità da fattori non maschili sottoposti a fecondazione in vitro con PGT-A presso il Texas Fertility Center all'inseminazione convenzionale o all'ICSI. Saranno incluse donne di età compresa tra 18 e 39 anni con almeno 10 ovociti dopo il prelievo. L'analisi iniziale del seme deve avere un numero maggiore o uguale a 16 milioni di spermatozoi/mL, 42% di spermatozoi mobili, 16,4 milioni di spermatozoi mobili totali, 30% di motilità progressiva e 4% di morfologia normale (come definito dalla 6a edizione dell'OMS). I pazienti saranno esclusi per uno qualsiasi dei seguenti: qualsiasi fallimento della fecondazione o più di un fallimento dell'impianto da precedenti cicli di fecondazione in vitro; infertilità da fattore maschile come definita da concentrazione di spermatozoi inferiore a 16 milioni di spermatozoi/mL, motilità inferiore al 42%, conteggio totale dei mobili inferiore a 16,4 milioni, motilità progressiva inferiore al 30% e morfologia normale inferiore al 4%; partner femminile di età superiore ai 39 anni; 9 o meno ovociti dopo il recupero; coppie che richiedono l'analisi di un singolo gene mediante test genetici preimpianto per malattie monogeniche (PGT-M); ICSI per qualsiasi motivo diverso da PGT-A.

La partner femminile sarà sottoposta a stimolazione ovarica controllata con un protocollo scelto dal medico di ciascuna paziente in base all'età, all'anamnesi e alla riserva ovarica della paziente. L'ormone follicolo stimolante ricombinante (FSH) (Gonal F o Follistim) e la gonadotropina umana della menopausa (Menopur) saranno utilizzati per la stimolazione. L'agonista dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) (Lupron) o l'antagonista (Cetrotide o Ganirelix) con o senza pillole contraccettive orali (OCP) o con innesco di estradiolo saranno utilizzati per la soppressione dell'ovulazione. Il paziente verrà monitorato ogni 1-3 giorni utilizzando gli ultrasuoni per misurare la crescita follicolare e i livelli di estradiolo nel sangue, con farmaci e dosaggio adeguati di conseguenza. La maturazione degli ovociti sarà innescata con l'agonista dell'ormone di rilascio delle gonadotropine (GnRH) (Lupron) e/o gonadotropina corionica umana (Novarel o Pregnyl). Il prelievo degli ovociti avverrà 36 ore dopo il trigger secondo i protocolli standard presso il nostro centro.

Gli ovociti saranno lavati con terreno di manipolazione multiuso (MHM) più 0,5% di albumina di siero umano (HSA). Le cellule del cumulo e il sangue in eccesso verranno tagliati. Gli ovociti saranno trasferiti in una piastra contenente Irvine Scientific Continuous Cell Culture Complete Medium con due ovociti per piastra. Il piatto verrà quindi trasferito nell'incubatrice.

Gli ovociti designati per l'ICSI saranno immediatamente esposti alla ialuronidasi per rimuovere il cumulo e le cellule coronali. Gli embriologi valuteranno lo stato di maturazione al microscopio invertito. L'ICSI sarà eseguita su tutti gli ovociti maturi in metafase II 4 ore dopo il prelievo. Gli ovociti iniettati verranno quindi posti in un piatto di coltura fresco e rimessi nell'incubatrice.

Per gli ovociti designati per l'inseminazione convenzionale, l'inseminazione avverrà 4-6 ore dopo il prelievo. Lo sperma sarà raccolto come un campione fresco e lavato con Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. La concentrazione e la motilità degli spermatozoi saranno valutate prima e dopo il lavaggio secondo i criteri della sesta edizione dell'OMS. Lo sperma sarà preparato per raggiungere una concentrazione di 200.000 spermatozoi per goccia da 100 microlitri. Ad ogni piatto verranno aggiunte 6 gocce di sperma preparato.

La mattina seguente dopo l'ICSI o l'inseminazione convenzionale (Giorno 1), gli ovociti saranno esaminati per la fecondazione. Gli zigoti con due pronuclei (2PN) saranno tenuti in coltura di gruppo per essere nuovamente valutati nei giorni 5, 6 e 7. Gli embrioni che raggiungono lo stadio di blastocisti saranno classificati morfologicamente dai nostri embriologi. La massa cellulare interna (ICM) e il trofectoderma riceveranno ciascuno un grado di buono (G), discreto (F) o scarso (P). Le blastocisti con gradi G o F saranno sottoposte a biopsia del trofectoderma e successiva vetrificazione. La biopsia del trofoectoderma verrà eseguita utilizzando un protocollo standard: le cellule del trofoblasto schiuse opposte alla massa cellulare interna verranno aspirate delicatamente nella pipetta per biopsia. Il laser SaturnActive verrà utilizzato per separare 3-5 cellule. Le cellule biopsiate saranno preparate e caricate in tubi PCR secondo i protocolli del centro PGT-A e conservate a -20 gradi Celsius fino al trasporto al centro di test.

Il sequenziamento di nuova generazione verrà utilizzato per analizzare i campioni presso un centro di test PGT (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI o Genomic Prediction). Le variazioni del numero di copie verranno utilizzate per diagnosticare lo stato di ploidia. L'euploidia sarà definita come un numero normale di cromosomi. L'aneuploidia sarà definita come un numero anormale di cromosomi. Il mosaicismo sarà definito come mosaicismo al 30-70%, mentre un mosaicismo inferiore al 30% sarà considerato euploidia e un mosaicismo superiore al 70% sarà considerato aneuploidia. Gli esiti di PGT-A saranno analizzati per la percentuale di embrioni euploidi, aneuploidi, mosaici e senza risultato.