Estudo Prospectivo Randomizado Comparando ICSI com Inseminação para Pacientes com Fator Não Masculino Submetidos a PGT-A

A injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) é um procedimento realizado durante a fertilização in vitro (FIV) em que um único espermatozoide é injetado diretamente em um oócito. Este procedimento foi desenvolvido para a infertilidade do fator masculino devido à sua necessidade de um número muito pequeno de espermatozoides viáveis. As taxas de fertilização foram observadas em aproximadamente 60-70%, comparáveis ​​à inseminação tradicional. Seu uso se expandiu e agora é recomendado para ciclos de fertilização in vitro em que o teste genético pré-implantação para aneuploidias (PGT-A) é realizado em blastocistos. Com o PGT-A, embriões euploides podem ser selecionados para transferência, aumentando as taxas de implantação, elevando as taxas de gravidez contínua e reduzindo a incidência de aborto espontâneo. A recomendação de utilizar ICSI para todos os ciclos de PGT-A foi inicialmente baseada em garantir a fertilização monospérmica e minimizar a contaminação de esperma adicional ligado à zona pelúcida do oócito durante o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) para testes genéticos. No entanto, isso é menos preocupante com técnicas moleculares de sequenciamento de próxima geração que são usadas agora e permitem análises de resolução muito maior.

Tem sido sugerido que ICSI pode aumentar ligeiramente o risco de distúrbios de imprinting e defeitos congênitos, e aumenta significativamente o custo da fertilização in vitro. A meiose II ocorre durante a fertilização do oócito e, como tal, qualquer interrupção do aparato da meiose pode levar a erros na divisão cromossômica. Nossa hipótese é que o procedimento de ICSI pode interferir no processo normal da meiose e levar a uma maior taxa de blastocistos aneuplóides.

Nosso estudo atribuirá aleatoriamente pacientes com infertilidade por fator não masculino submetidos a fertilização in vitro com PGT-A no Texas Fertility Center para inseminação convencional ou ICSI. Serão incluídas mulheres com idade entre 18 e 39 anos com pelo menos 10 ovócitos após a coleta. A análise inicial do sêmen deve ter maior ou igual a 16 milhões de espermatozoides/mL, 42% de espermatozoides móveis, 16,4 milhões de espermatozoides móveis totais, 30% de motilidade progressiva e 4% de morfologia normal (conforme definido pela 6ª edição da OMS). Os pacientes serão excluídos por qualquer um dos seguintes: qualquer falha de fertilização ou mais de uma falha de implantação de ciclos anteriores de fertilização in vitro; infertilidade de fator masculino definida pela concentração de esperma inferior a 16 milhões de espermatozoides/mL, motilidade inferior a 42%, contagem total de mobilidade inferior a 16,4 milhões, motilidade progressiva inferior a 30% e morfologia normal inferior a 4%; companheira com mais de 39 anos; 9 ou menos oócitos após a coleta; casais que requerem análise de gene único por teste genético pré-implantação para distúrbios monogênicos (PGT-M); ICSI por qualquer motivo que não seja PGT-A.

A parceira passará por estimulação ovariana controlada com um protocolo escolhido pelo médico de cada paciente com base na idade, histórico e reserva ovariana da paciente. Hormônio folículo estimulante recombinante (FSH) (Gonal F ou Follistim) e gonadotrofina menopáusica humana (Menopur) serão usados ​​para estimulação. Agonistas (Lupron) ou antagonistas do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) (Cetrotide ou Ganirelix) com ou sem pílulas anticoncepcionais orais (ACOs) ou com priming de estradiol serão usados ​​para supressão da ovulação. A paciente será monitorada a cada 1-3 dias utilizando ultrassom para medir o crescimento folicular, bem como os níveis de estradiol no sangue, com medicação e dosagem ajustada de acordo. A maturação oocitária será desencadeada com agonista do hormônio liberador de gonadotropina (GnRH) (Lupron) e/ou gonadotrofina coriônica humana (Novarel ou Pregnyl). A recuperação de oócitos ocorrerá 36 horas após o acionamento de acordo com os protocolos padrão em nosso centro.

Os oócitos serão lavados com meio de manipulação multiuso (MHM) mais 0,5% de albumina sérica humana (HSA). O excesso de células cúmulos e sangue será aparado. Os oócitos serão transferidos para uma placa contendo Meio Completo de Cultura Celular Contínua Irvine Scientific com dois oócitos por placa. O prato será então transferido para a incubadora.

Os oócitos designados para ICSI serão imediatamente expostos à hialuronidase para remover o cumulus e as células coronais. Os embriologistas avaliarão o estado de maturação sob microscopia invertida. A ICSI será realizada em todos os oócitos maduros em metáfase II 4 horas após a coleta. Os oócitos injetados serão então colocados em uma placa de cultura fresca e devolvidos à incubadora.

Para oócitos designados para inseminação convencional, a inseminação ocorrerá 4-6 horas após a coleta. O esperma será coletado como uma amostra fresca e lavado com Irvine Scientific Continuous Single Culture-NX. A concentração e motilidade do esperma serão avaliadas antes e depois da lavagem de acordo com os critérios da 6ª edição da OMS. O esperma será preparado para atingir uma concentração de 200.000 espermatozoides por gota de 100 microlitros. 6 gotas de esperma preparado serão adicionadas a cada prato.

Na manhã seguinte após ICSI ou inseminação convencional (Dia 1), os oócitos serão examinados para fertilização. Os zigotos com dois pronúcleos (2PN) serão mantidos em cultura de grupo para serem novamente avaliados nos dias 5, 6 e 7. Os embriões que atingirem o estágio de blastocisto serão classificados morfologicamente por nossos embriologistas. A Massa Celular Interna (ICM) e o trofectoderma receberão, cada um, uma classificação de Bom (G), Regular (F) ou Ruim (P). Blastocistos com graus G ou F serão submetidos à biópsia do trofectoderma e posterior vitrificação. A biópsia do trofectoderma será realizada usando um protocolo padrão: as células trofoblásticas incubadas opostas à massa celular interna serão aspiradas suavemente para a pipeta de biópsia. O laser SaturnActive será usado para separar 3-5 células. As células biopsiadas serão preparadas e carregadas em tubos de PCR de acordo com os protocolos do centro PGT-A e armazenadas a -20 graus Celsius até o transporte para o centro de testes.

O sequenciamento de próxima geração será usado para analisar amostras em um centro de testes PGT (Ovation Genetics, Cooper Genomics, Natera, RGI ou Genomic Prediction). As variações do número de cópias serão usadas para diagnosticar o status da ploidia. A euploidia será definida como um número normal de cromossomos. A aneuploidia será definida como um número anormal de cromossomos. Mosaicismo será definido como 30-70% de mosaicismo, enquanto menos de 30% de mosaicismo será considerado euploidia e mais de 70% de mosaicismo será considerado aneuploidia. Os resultados do PGT-A serão analisados ​​quanto à porcentagem de embriões euploides, aneuploides, em mosaico e sem resultado.