持久力トレーニングとスピードパワートレーニングへの長期適応が血漿遊離アミノ酸濃度に及ぼす影響 (AAdaptation)

I. 学習目標

2 つの異なるトレーニング モダリティ - スピード パワー トレーニングと持久力トレーニング - の長期的な効果を、安静時の血漿中遊離アミノ酸 (PFAA) 濃度の変化に及ぼす影響を比較しました。 私たちのモデル コホートは、高度なトレーニングを受けたアスリートでした。 私たちの仮定は、構造化された長期にわたるスピードパワーと持久力トレーニングが適応を引き起こし、異なるPFAA濃度をもたらすというものでした. この変化は、長期的なスポーツの専門化 (優勢な運動タイプ) と 1 年サイクルのトレーニング段階 (急速なアデノシン 5'-三リン酸分解を特徴とする無酸素代謝に基づく高強度運動の寄与) に依存すると仮定しました。 高強度の運動のより大きな貢献は、スピードパワーのアスリートや特定の準備/競技の段階で使用されます. PFAA の変化に対する身体トレーニングの長期的な影響に関する研究は不足しています。 42 のタンパク原性および非タンパク原性 PFAA のセットの変化を監視することにより、この状況を補足します。 運動中および回復中の PFAA 濃度のレベルおよび時間経過に対するトレーニングの短期的および長期的効果が示されます。 主な目標は次のとおりです。

1. PFAA濃度に対する2つのまったく異なるトレーニングモダリティ（スピードパワーと持久力）の効果を比較する.
2. 1 年間のトレーニング サイクルの連続したトレーニング フェーズにおける、安静時、運動中、および運動後の PFAA 濃度の変化に対するトレーニング負荷特性の影響を観察すること。
3. 骨格筋量を考慮して、PFAA 濃度と運動様式との関連性を判断すること。

Ⅱ．バックグラウンド

長時間の持久力運動中に利用される総エネルギーの 3 ～ 6% のみが AA の酸化に由来します (Hargreaves & Snow 2001、Tarnopolski 2004、Wolfe et al. 1984)。 しかし、AA異化によるエネルギーの割合は、運動中にかなり増加します (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981)。 タンパク質代謝回転はエネルギー消費に実質的には寄与しませんが、運動中の他の重要な機能を満たしている可能性があります (Newsholm & Leech 2010)。 AA は筋肉のグリコーゲン枯渇を遅らせる可能性があり (Lemon & Mullin 1980)、肝臓の糖新生をサポートします (Ahlborg et al. 1974、Ahlborg & Felig 1982、Felig & Wahren 1971)。

遊離 AA プールは総 AA 量のわずか 2% であり、血漿および細胞内および細胞外スペース内に保存されます。 この小さなプールは、AA の継続的な交換を説明しています (Wagemakers 1998)。 血漿は AA の一時的な貯蔵庫として機能し、そのサイズは運動に応じて変化します。 定期的なトレーニング、運動、および日常活動の違いは、PFAA レベルの違いをもたらします (Einspahr & Tharp 1989、Henriksson 1991、Xiao et al. 2016)。

運動時間は PFAA レベルに影響を与えますが、変化の方向は特定の AA および運動の種類、強度、および持続時間によって異なる場合があります (Ahlborg et al. 1974、Areces et al. 2015、Blomstrand et al. 1988、Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie and Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson 1991, Huq et al. 1993, Ishikura et al. al. 2008、Pitkänen et al. 2002a、Rennie et al. 1981、Ward et al. 1999)。 対照的に、筋肉の AA 濃度は比較的安定しています (Graham 1995、Henriksson 1991、Rennie 1981)。

長時間の運動中の AA 代謝が報告されています (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001)。 パワー系アスリートの短いトレーニング期間 (5 週間) に基づくある研究では、短距離走と持久力トレーニング セッションが血清 AA に明確な影響を与えることが示唆されています (Pitkänen 2002b)。 しかし、複数回の採血（休息、運動、回復）と筋肉量を考慮して、持久力トレーニングとスプリントトレーニングを受けた個人の間のPFAAの長期適応変化の違いに関する研究は不足しています.

III.メソッド

18 歳から 32 歳までの 70 人以上のアスリート (スピード パワー (スプリンター)、持久力 (トライアスロン選手、長距離走者)、レクリエーション トレーニング) が採用されました。 最終的に、そのうちの 58 件のデータが分析のために検討されました。 アスリートは、1 年間のトレーニング サイクル中に、(1) 一般的な準備段階、(2) 特定の準備段階、(3) 競技段階、および (4) 移行段階の 4 回検査を受けました。

主な統計ツールは、反復測定による一元配置および二元配置の ANOVA でした。 必要なサンプル サイズは、特定のアルファ (有意性) レベル、統計的検出力、および効果サイズに基づいて計算されました。 有意水準 α < 0.05 と統計的検出力 0.8 を仮定しました。 短距離走と持久力のトレーニングを受けたアスリートを、トレーニングと運動に関連する他の代謝現象に関して比較した以前の研究に基づいて (Zieliński, Kusy 2012)、0.2 の最小部分イータ 2 乗 (η2) が採用されました。検査されたグループと連続した検査の間の違いが予想されました。 その他の仮定は、非球面補正 = 0.75、測定数 = 4、繰り返し測定間の相関 = 0.5 でした。 22 人のアスリートの最小合計サンプルサイズが得られました。

体組成は、二重X線吸収測定法（Lunar Prodigy、GE Healthcare、USA）を使用して評価されました。 骨格筋量は、回帰方程式を使用して推定されました (Kim et al. 2002、Kim et al. 2006)。

トレッドミル (h/p/cosmos、ドイツ) での段階的な運動テストは、標準的な食事の 2 時間後の午前 12 時前に実施されました。 初速は 8 km/h で、3 分ごとに 2 km/h ずつ速度を上げていきました。 呼吸パラメーターと心拍数を測定しました (エルゴスピロメーター MetaLyzer 3B、Cortex、ドイツ; Polar Elektro RS 400、フィンランド)。 最大酸素消費量が測定されました。

採血。 末梢静脈カテーテルを背側中手骨静脈に留置した。 血液サンプルは、安静時、運動中 (3 分ごと、各速度変更時)、および運動終了直後、5、10、15、20、および 30 分後に採取されました。 1 回の検査で得られた静脈血の量は 25 ml、つまり各サンプルで 2.5 ml、最大 10 サンプルでした。 さらなる血漿分析のために、各サンプルをEDTAを含む血漿分離チューブに収集した。 サンプルを 13,000 回転/分で 3 分間、4°C で遠心分離しました。 次いで、得られた血漿をピペットで0.5mlのバイアルに移し、液体窒素で直ちに凍結した。 サンプルは分析まで-80℃で保存されました。

42 種類の PFAA を分析しました: O-ホスホ-L-セリン、O-ホスホエタノールアミン、タウリン、L-アスパラギン、L-セリン、ヒドロキシ-L-プロリン、グリシン、L-グルタミン、エタノールアミン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、サルコシン、β-アラニン、L-アラニン、L-スレオニン、L-グルタミン酸、L-ヒスチジン、1-メチル-L-ヒスチジン、3-メチル-L-ヒスチジン、L-ホモシトルリン、アルギニノコハク酸、γ-アミノ-n-酪酸、D、L-β-アミノイソ酪酸、L-α-アミノ-n-酪酸、L-α-アミノアジピン酸、L-アンセリン、L-カルノシン、L-プロリン、L-アルギニン、δ -ヒドロキシリジン、L-オルニチン、シスタチオニン、L-シスチン、L-リジン、L-バリン、L-メチオニン、L-チロシン、L-ホモシスチン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン。 PFAA の分析は、LC-ESI-MS/MS 技術と aTRAQ (Sciex) 試薬に基づいており、高い感度と特異性、短い分析実行時間、分析の実行に必要なサンプル量が少なく、分析対象物が多いという特徴があります。 1 回の実行で定量化されます。

PFAAs の決定のためのプロトコル。 40μlの血漿サンプルをエッペンドルフチューブに移した。 血漿中に存在するタンパク質を沈殿させるために、10% スルホサリチル酸 10 μl を加え、内容物を混合し、遠心分離 (10,000 g で 2 分間) しました。 その後、上清を新しいチューブに移し、40 μl のホウ酸緩衝液と混合しました。 続いて、得られた溶液の１０μｌのアリコートをａＴＲＡＱ試薬Δ８溶液（５μｌ）で標識し、混合し、遠心分離し、室温で３０分間インキュベートした。 次いで、１．２％ヒドロキシルアミン５μｌを添加して標識反応を停止させ、混合し、室温で１５分間インキュベートした。 その後、内部標準溶液を32μl添加し、内容物を混合した。 次のステップでは、サンプルを真空濃縮器で 15 分間蒸発させて、サンプルの容量を約 20 µl に減らしました。 次に、残留物を 20 µl の水で希釈して混合し、インサート付きのオートサンプラー バイアルに移しました。 この手順は、元の方法を使用して検出できなかった PFAAs の濃度を測定するために変更されました。 この目的のために、より大量の血漿サンプルをサンプル調製手順に使用した。 40μlの代わりに、80μlの血漿サンプルをエッペンドルフチューブに移し、20μlの10%スルホサリチル酸と混合した。 その後、20μlの上清を新しいチューブに移し、30μlのホウ酸緩衝液と混合した。 手順の後続のステップは変更されていません。 内部標準溶液には、aTRAQ試薬Δ0で標識された同じAAが含まれていました。 したがって、決定された各 PFAA には、対応する内部標準がありました。 ノルロイシンとノルバリン、2 つの非タンパク新生 AA を使用して、標識効率と回収率を評価しました。 それらの対応する内部標準は、内部標準溶液にも存在していました。

分析は、4000 QTRAP (四重極イオントラップ) 質量分析計 (Sciex) に接続された液体クロマトグラフィー機器 1260 Infinity (Agilent Technologies) を使用して実行されました。 この質量分析計には、エレクトロ スプレー イオン化ソースと 3 つの四重極が装備されており、提示されたプロジェクト内で計画されている定量的 PFAA 分析を行うことができます。 クロマトグラフィー分離は、Sciex C18 (5 μm、4.6 mm x 150 mm) クロマトグラフィー カラムを使用して実行されました。 移動相の流量は 800 μl/分に維持されました。 この方法では、次の移動相を使用します: 水 (相 A) とメタノール (相 B) の両方に、0.1 % のギ酸と 0.01 % のヘプタフルオロ酪酸を追加します。 分析時間は１８分であり、その間、クロマトグラフ分離は次の勾配溶離で実施された：０から６分まで－相Ｂの２％から４０％、次いで相Ｂの４０％で４分間維持。 、１１分までフェーズＢの９０％に増加し、その比率のフェーズで１分間保持し、次にフェーズＢの２％に減少し、最終的に１３分から１８分までフェーズＢの２％に維持した。 注入量は 2 μl に設定し、分離温度は 50 °C に設定しました。 イオン源の設定は次のとおりです。イオンスプレー電圧 4500 V;イオン源温度 600 °C。イオン源ガス 1 = 60 psig、イオン源ガス 2 = 50 psig。 質量分析計は陽イオン化モードで操作し、次のパラメーターを適用しました。入口電位 = 10 V。デクラスター化の可能性 = 30 V。衝突セル出口電位 = 5 V;衝突エネルギー = 30 eV (7 化合物の場合は 50 eV);衝突ガス：窒素。 PFAA は、スケジュールされた多重反応モニタリング (sMRM) モードで測定されました。 このモードは、定量分析において高い特異性と感度を保証します。 システム適合性テスト (AA の標準混合物の分析) は、サンプルの各バッチの前に実施され、システム全体のウォームアップと日間パフォーマンスをチェックしました。 Analyst 1.5ソフトウェア（Sciex）を使用して、データの取得と処理を実行しました。 記載されている AAs の測定のための LC-ESI-MS/MS メソッドは、プロジェクトの共同研究者であるポズナン医科大学の無機分析化学科で十分に確立されています (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015、Klupczyńska et al. 2016、Matysiak et al. 2014)。

装置 Mythic 18 (Orphée、Swiss) を使用して総血球計算を実施しました。 運動前、運動中、および運動後に、指先からの毛細管血サンプル（サンプルあたり20μl）を静脈血と同時に採取しました。 血中乳酸濃度は、C ライン アナライザー (EKF-Diagnostic、ドイツ) を使用して測定しました。