혈장 유리 아미노산 농도에 대한 지구력 및 스피드-파워 트레이닝에 대한 오래 지속되는 적응의 효과 (AAdaptation)

I. 공부 목표

우리는 피로와 회복 기간까지 단계적 운동 동안 휴식 시 혈장 유리 아미노산(PFAA) 농도의 변화에 ​​대한 두 가지 다른 훈련 양식(속도-파워 및 지구력 훈련)의 장기적 효과를 비교했습니다. 우리의 모델 코호트는 고도로 훈련된 운동선수였습니다. 우리의 가정은 구조화 된 오래 지속되는 속도와 지구력 훈련이 다른 PFAA 농도를 초래하는 적응을 유발한다는 것입니다. 우리는 변화가 장기적인 스포츠 전문화(우세한 운동 유형)와 1년 주기의 훈련 단계(빠른 아데노신-5'-삼인산 분해를 특징으로 하는 혐기성 대사에 기반한 고강도 운동의 기여)에 달려 있다고 가정했습니다. 고강도 운동의 더 큰 기여는 스피드 파워 운동 선수와 특정 준비/경기 단계에서 사용됩니다. PFAA의 변화에 ​​대한 신체 훈련의 장기적인 영향에 대한 연구가 부족합니다. 우리는 42개의 proteinogenic 및 non-proteinogenic PFAA 세트의 변화를 모니터링하여 이 그림을 보완합니다. 운동 및 회복 중 PFAA 농도 수준 및 시간 경과에 대한 훈련의 단기 및 장기 효과가 표시됩니다. 주요 목표는 다음과 같습니다.

1. PFAA 농도에 대한 두 가지 완전히 다른 훈련 양식(속도-파워 및 지구력)의 효과를 비교합니다.
2. 1년 훈련 주기의 연속 훈련 단계에서 휴식, 운동 및 운동 후 PFAA 농도의 변화에 ​​대한 훈련 부하 특성의 영향을 관찰합니다.
3. 골격근량을 고려하여 PFAA 농도와 운동 방식 사이의 연관성을 결정합니다.

II. 배경

장기간의 지구력 운동 중에 사용되는 총 에너지의 3-6%만이 AA의 산화에서 파생됩니다(Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). 그러나 운동 중에는 AA 이화작용에서 나오는 에너지의 비율이 상당히 증가합니다(Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). 단백질 회전율은 에너지 소비에 크게 기여하지 않지만 운동 중 다른 중요한 기능을 수행할 수 있습니다(Newsholm & Leech 2010). AA는 근육 글리코겐 고갈을 지연시킬 수 있으며(Lemon & Mullin 1980) 간 포도당신생합성을 지원합니다(Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

무료 AA 풀은 총 AA 양의 2%에 불과하며 혈장과 세포 내 및 세포 외 공간에 저장됩니다. 이 작은 풀은 AA의 지속적인 교환을 설명합니다(Wagenmakers 1998). 혈장은 운동에 반응하여 크기가 변하는 AA의 임시 저장고 역할을 합니다. 정기적인 훈련, 운동 및 일상 활동의 차이는 PFAA 수준의 차이를 초래합니다(Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

운동 시간은 PFAA 수준에 영향을 주지만 특정 AA 및 운동 유형, 강도 및 기간에 따라 변화 방향이 다를 수 있습니다(Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik 외 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier 외 2001, Decombaz 1979, Graham 외 1995, Haralambie 및 Berg 1976, Hassmén 외 1994, Henriksson 1991, Huq 외 1993, Ishikura 외 외 2008, Pitkänen 외 2002a, Rennie 외 1981, Ward 외 1999). 대조적으로, 근육 AA 농도는 상대적으로 안정적으로 유지됩니다(Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

장기간 운동 중 AA 대사가 기술되었습니다(Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). 파워 타입 운동선수의 짧은 훈련 기간(5주)에 기반한 한 연구는 스프린트 및 지구력 훈련 세션이 혈청 AA에 뚜렷한 영향을 미친다고 제안합니다(Pitkänen 2002b). 그러나 다중 혈액 샘플링(휴식, 운동, 회복) 및 근육량을 고려하여 지구력 및 스프린트 훈련을 받은 개인 간의 PFAA의 장기 적응 변화 차이에 대한 연구는 부족합니다.

III. 행동 양식

18세에서 32세 사이의 70명 이상의 선수 - 스피드 파워(단거리 선수), 지구력(철인 3종 경기 선수, 원거리 달리기 선수) 및 레크리에이션 훈련을 받은 선수 -가 모집되었습니다. 결국 이들 중 58개의 데이터가 분석 대상으로 고려되었습니다. 선수들은 1년의 훈련 주기 동안 4번 검사를 받았습니다: (1) 일반 준비 단계, (2) 특정 준비 단계, (3) 경쟁 단계 및 (4) 전환 단계.

주요 통계 도구는 반복 측정을 사용하는 일원 및 양방향 ANOVA였습니다. 필요한 샘플 크기는 주어진 알파(유의성) 수준, 통계 검정력 및 효과 크기를 기반으로 계산되었습니다. 유의 수준 α < 0.05 및 통계 검정력을 0.8로 가정했습니다. 훈련과 운동(Zieliński, Kusy 2012)과 관련된 다른 대사 현상 측면에서 스프린트 및 지구력 훈련을 받은 운동선수를 비교한 이전 연구를 기반으로 0.2의 최소 부분 에타 제곱(η2)이 채택되었습니다. 검사 그룹과 연속 검사 간의 차이가 예상되었습니다. 다른 가정은 비구형 보정 = 0.75, 측정 횟수 = 4, 반복 측정 간의 상관 관계 = 0.5입니다. 22명의 운동선수의 최소 총 표본 크기를 얻었습니다.

체성분은 dual X-ray absorptiometry (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA)를 사용하여 평가되었습니다. 골격근량은 회귀식을 이용하여 추정하였다(Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

런닝머신(h/p/cosmos, 독일)에서 단계별 운동 테스트는 표준 식사 2시간 후인 오전 12시 이전에 실시되었습니다. 초기 속도는 8km/h였으며 지칠 때까지 3분마다 2km/h씩 증가했습니다. 호흡 매개변수 및 심박수를 측정했습니다(ergospirometer MetaLyzer 3B, 독일 Cortex, 핀란드 Polar Elektro RS 400). 최대 산소 소비량을 측정했습니다.

혈액 샘플링. 말초 정맥 카테터를 배측 중수 정맥에 넣었습니다. 혈액 샘플은 안정 시, 운동 중(3분마다, 각 속도 변경 시), 운동 완료 후 즉시, 5분, 10분, 15분, 20분 및 30분에 채취했습니다. 한 번의 검사에서 얻은 정맥혈의 양은 25ml, 즉 각 샘플당 2.5ml, 최대 10개 샘플입니다. 추가 플라즈마 분석을 위해 각 샘플을 EDTA가 포함된 플라즈마 분리 튜브에 수집했습니다. 샘플을 4°C에서 3분 동안 13,000회전/분으로 원심분리했습니다. 얻어진 혈장을 0.5ml 바이알에 피펫팅하고 즉시 액체 질소에서 동결시켰다. 샘플은 분석할 때까지 -80°C에 보관했습니다.

42개의 PFAA가 분석되었습니다. , 사르코신, β-알라닌, L-알라닌, L-트레오닌, L-글루탐산, L-히스티딘, 1-메틸-L-히스티딘, 3-메틸-L-히스티딘, L-호모시트룰린, 아르기니노숙신산, γ-아미노 -n-부티르산, D, L-β-아미노이소부티르산, L-α-아미노-n-부티르산, L-α-아미노아디프산, L-안세린, L-카르노신, L-프롤린, L-아르기닌, δ -하이드록시라이신, L-오르니틴, 시스타티오닌, L-시스틴, L-라이신, L-발린, L-메티오닌, L-티로신, L-호모시스틴, L-이소류신, L-류신, L-페닐라닌, L-트립토판. PFAA의 분석은 LC-ESI-MS/MS 기술과 aTRAQ(Sciex) 시약을 기반으로 했으며, 높은 감도와 특이성, 짧은 분석 실행 시간, 분석 수행에 필요한 적은 시료량, 많은 양의 분석물을 특징으로 합니다. 한 번의 실행으로 정량화됩니다.

PFAA 결정을 위한 프로토콜. 40 μl의 혈장 샘플을 Eppendorf 튜브로 옮겼습니다. 혈장에 존재하는 단백질을 침전시키기 위해 10% 설포살리실산 10㎕를 첨가하고 내용물을 혼합한 후 원심분리(10,000g, 2분간)하였다. 그 후, 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 40 ㎕의 붕산염 완충액과 혼합하였다. 얻어진 용액 10 ㎕의 분취액을 aTRAQ 시약 Δ8 용액(5 ㎕)으로 표지하고, 혼합하고, 원심분리하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 1.2% 하이드록실아민 5㎕를 첨가하여 표지 반응을 중단하고 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양했습니다. 그 후, 내부 표준 용액 32㎕를 첨가하고 내용물을 혼합하였다. 다음 단계에서 샘플을 진공 농축기에서 15분 동안 증발시켜 샘플의 부피를 약 20 μl로 줄였다. 그런 다음 잔류물을 20μl의 물로 희석하고 혼합한 다음 삽입물이 있는 자동 시료 주입기 바이알로 옮겼습니다. 이 절차는 원래 방법을 사용하여 검출할 수 없는 PFAA의 농도를 측정하기 위해 수정되었습니다. 이를 위해 샘플 준비 절차에 더 많은 양의 혈장 샘플을 사용했습니다. 40μl 대신에 80μl의 혈장 샘플을 Eppendorf 튜브로 옮기고 20μl의 10% 설포살리실산과 혼합했습니다. 그 후, 20 μl의 상등액을 새로운 튜브로 옮기고 30 μl의 borate 완충액과 혼합하였다. 절차의 후속 단계는 변경되지 않았습니다. 내부 표준 용액에는 aTRAQ 시약 Δ0으로 라벨링된 동일한 AA가 포함되어 있습니다. 따라서 결정된 각 PFAA에는 해당 내부 표준이 있습니다. 2개의 비단백질성 AA인 노르류신 및 노르발린을 사용하여 표지화 효율 및 회복을 평가하였다. 해당 내부 표준은 내부 표준 솔루션에도 존재했습니다.

분석은 4000 QTRAP(quadrupole ion trap) 질량 분석기(Sciex)에 연결된 액체 크로마토그래피 기기 1260 Infinity(Agilent Technologies)를 사용하여 수행되었습니다. 이 질량 분석계는 전기 분무 이온화 소스와 3개의 사중극자를 갖추고 있으며 제시된 프로젝트 내에서 계획된 정량적 PFAA 분석을 수행할 수 있습니다. 크로마토그래피 분리는 Sciex C18(5μm, 4.6mm x 150mm) 크로마토그래피 컬럼으로 수행되었습니다. 이동상의 유속은 800 μl/min으로 유지되었습니다. 이 방법은 다음 이동상을 사용합니다: 물(상 A) 및 메탄올(상 B), 모두 0.1% 포름산 및 0.01% 헵타플루오로부티르산이 첨가됩니다. 분석 시간은 18분이었고 그 시간 동안 크로마토그래피 분리는 다음 구배 용리로 수행되었습니다: 0에서 6분까지 - 상 B의 2%에서 40%, 그런 다음 상 B의 40%에서 4분 동안 유지 , 11분까지 단계 B의 90%로 증가하고 1분 동안 해당 비율 단계에서 유지한 다음 단계 B의 2%로 감소하고 최종적으로 13분에서 18분까지 단계 B의 2%를 유지합니다. 주입 부피는 2 μl로, 분리 온도는 50 °C로 설정했습니다. 이온 소스 설정은 다음과 같습니다: 커튼 가스 20psig; 이온 분무 전압 4500V; 이온 소스 온도 600°C; 이온 소스 가스 1 = 60psig, 이온 소스 가스 2 = 50psig. 질량 분석기는 양이온화 모드에서 작동하고 다음 매개변수가 적용되었습니다: 입구 전위 = 10V; 디클러스터링 전위 = 30V; 충돌 셀 출구 전위 = 5V; 충돌 에너지 = 30eV(7개 화합물의 경우 50eV); 충돌 가스: 질소. PFAA는 예정된 다중 반응 모니터링(sMRM) 모드에서 측정되었습니다. 이 모드는 정량 분석에서 높은 특이성과 감도를 보장합니다. 전체 시스템의 일일 성능을 워밍업하고 확인하기 위해 샘플의 각 배치 전에 시스템 적합성 테스트(AA의 표준 혼합물 분석)를 수행했습니다. 데이터 수집 및 처리는 Analyst 1.5 소프트웨어(Sciex)를 사용하여 수행되었습니다. AA 결정을 위한 설명된 LC-ESI-MS/MS 방법은 프로젝트의 공동 조사자인 Poznan University of Medical Sciences의 무기 및 분석 화학과에서 잘 확립되어 있습니다(Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska 외 2016, Matysiak 외 2014).

총 혈구 수는 장치 Mythic 18(Orphée, Swiss)을 사용하여 수행되었습니다. 손가락 끝에서 모세혈관 혈액 샘플(샘플당 20μl)을 운동 전, 운동 중 및 운동 후에 정맥혈과 동시에 채취했습니다. 혈중 젖산 농도는 C-line analyzer(EKF-Diagnostic, Germany)를 이용하여 측정하였다.