Efecto de la Adaptación Duradera al Entrenamiento de Resistencia y Velocidad-Potencia sobre la Concentración de Aminoácidos Libres en Plasma (AAdaptation)

I. Objetivo del estudio

Comparamos el efecto a largo plazo de dos modalidades de entrenamiento diferentes (velocidad-potencia y entrenamiento de resistencia) sobre los cambios en la concentración de aminoácidos libres en plasma (PFAA) en reposo, durante el ejercicio gradual hasta el agotamiento y el período de recuperación. Nuestras cohortes modelo eran atletas altamente entrenados. Nuestra suposición fue que el entrenamiento estructurado de velocidad-potencia y resistencia de larga duración causa adaptaciones que resultan en diferentes concentraciones de PFAA. Asumimos que los cambios dependen de la especialización deportiva a largo plazo (tipo de ejercicio predominante) y la fase de entrenamiento del ciclo de un año (contribución del ejercicio de alta intensidad basado en el metabolismo anaeróbico caracterizado por una rápida degradación de adenosina-5'-trifosfato). Los deportistas de velocidad-potencia y en fases de preparación/competencia específica utilizan una mayor contribución del ejercicio de alta intensidad. Hay una falta de investigación sobre los efectos a largo plazo del entrenamiento físico en los cambios en los PFAA. Complementamos esta imagen monitoreando los cambios en un conjunto de 42 PFAA proteinogénicos y no proteinogénicos. Se mostrarán los efectos a corto y largo plazo del entrenamiento sobre los niveles y el curso temporal de la concentración de PFAA durante el ejercicio y la recuperación. Los principales objetivos eran:

1. Comparar el efecto de dos modalidades de entrenamiento completamente diferentes (velocidad-potencia y resistencia) sobre la concentración de PFAA.
2. Observar el efecto del carácter de la carga de entrenamiento sobre los cambios en la concentración de PFAA en reposo, ejercicio y post-ejercicio en fases de entrenamiento consecutivas de un ciclo de entrenamiento de un año.
3. Determinar el vínculo entre la concentración de PFAA y la modalidad de ejercicio, teniendo en cuenta la masa muscular esquelética.

II. Fondo

Solo el 3-6% de la energía total utilizada durante el ejercicio de resistencia prolongado se deriva de la oxidación de AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Sin embargo, la proporción de energía del catabolismo AA aumenta considerablemente durante el ejercicio (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Aunque el recambio de proteínas no contribuye sustancialmente al gasto de energía, puede desempeñar otras funciones importantes durante el ejercicio (Newsholm & Leech 2010). Los AA pueden retrasar el agotamiento del glucógeno muscular (Lemon & Mullin 1980) y apoyar la gluconeogénesis hepática (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

La reserva de AA libre representa solo el 2% de la cantidad total de AA y se almacena en el plasma y en los espacios intra y extracelular. Este pequeño grupo representa un intercambio continuo de AA (Wagenmakers 1998). El plasma sanguíneo sirve como reservorio temporal de AA, cuyo tamaño cambia en respuesta al ejercicio. Las diferencias en el entrenamiento regular, el ejercicio y las actividades diarias dan como resultado diferencias en los niveles de PFAA (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

La duración del ejercicio afecta los niveles de PFAA; sin embargo, la dirección de los cambios puede ser diferente para los AA específicos y el tipo, la intensidad y la duración del ejercicio (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie y Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson 1991, Huq et al. 1993, Ishikura et al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). Por el contrario, la concentración muscular de AA permanece relativamente estable (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Se ha descrito el metabolismo del AA durante el ejercicio prolongado (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Una investigación basada en un período de entrenamiento corto (5 semanas) en atletas de potencia sugiere que las sesiones de entrenamiento de velocidad y resistencia tienen un efecto distinto sobre los AA séricos (Pitkänen 2002b). Sin embargo, faltan estudios sobre las diferencias en los cambios de adaptación a largo plazo en los PFAA entre individuos entrenados en resistencia y sprint, teniendo en cuenta múltiples muestras de sangre (descanso, ejercicio, recuperación) y masa muscular.

tercero Métodos

Se reclutaron más de 70 atletas de entre 18 y 32 años: velocidad-potencia (velocistas), resistencia (triatletas, corredores de fondo) y entrenados recreativamente. Finalmente, se consideraron para el análisis los datos de 58 de ellos. Los atletas fueron examinados cuatro veces durante el ciclo de entrenamiento de un año: (1) fase de preparación general, (2) fase de preparación específica, (3) fase de competencia y (4) fase de transición.

La principal herramienta estadística fue ANOVA de una y dos vías con medidas repetidas. El tamaño de muestra requerido se calculó en función del nivel alfa (significativo), el poder estadístico y el tamaño del efecto dados. Asumimos el nivel de significación α < 0,05 y poder estadístico 0,8. Con base en nuestros estudios anteriores que compararon atletas entrenados en velocidad y resistencia en términos de otros fenómenos metabólicos relacionados con el entrenamiento y el ejercicio (Zieliński, Kusy 2012), se adoptó una eta cuadrada parcial mínima (η2) de 0.2, es decir, un tamaño de efecto grande para Se esperaban diferencias entre los grupos examinados y el examen consecutivo. Otras suposiciones fueron corrección de no esfericidad = 0,75, número de mediciones = 4 y correlación entre mediciones repetidas = 0,5. Se obtuvo el tamaño mínimo de muestra total de 22 deportistas.

La composición corporal se evaluó mediante absorciometría dual de rayos X (Lunar Prodigy, GE Healthcare, EE. UU.). La masa muscular esquelética se estimó usando ecuaciones de regresión (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Se realizaron pruebas de ejercicio gradual en una cinta rodante (h/p/cosmos, Alemania) antes de las 12 a. m., dos horas después de una comida estándar. La velocidad inicial era de 8 km/h y aumentaba cada 3 min en 2 km/h hasta el agotamiento. Se midieron los parámetros respiratorios y la frecuencia cardiaca (ergoespirómetro MetaLyzer 3B, Cortex, Alemania; Polar Elektro RS 400, Finlandia). Se midió el consumo máximo de oxígeno.

Muestra de sangre. Se colocó un catéter venoso periférico en la vena metacarpiana dorsal. Se extrajeron muestras de sangre en reposo, durante el ejercicio (cada 3 min, en cada cambio de velocidad) e inmediatamente, 5, 10, 15, 20 y 30 min después de la finalización del ejercicio. El volumen de sangre venosa obtenido durante un examen fue de 25 ml, es decir, 2,5 ml para cada muestra, hasta 10 muestras. Cada muestra se recogió en un tubo de separación de plasma que contenía EDTA para un análisis de plasma adicional. Las muestras se centrifugaron a 13.000 revoluciones/min durante 3 min a 4 °C. A continuación, el plasma obtenido se pipeteó en viales de 0,5 ml y se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido. Las muestras se almacenaron a -80°C hasta su análisis.

Se analizaron cuarenta y dos PFAA: O-fosfo-L-serina, O-fosfoetanolamina, taurina, L-asparagina, L-serina, hidroxi-L-prolina, glicina, L-glutamina, etanolamina, ácido L-aspártico, L-citrulina , sarcosina, β-alanina, L-alanina, L-treonina, ácido L-glutámico, L-histidina, 1-metil-L-histidina, 3-metil-L-histidina, L-homocitrulina, ácido argininosuccínico, γ-amino -ácido n-butírico, D, ácido L-β-aminoisobutírico, ácido L-α-amino-n-butírico, ácido L-α-aminoadípico, L-anserina, L-carnosina, L-prolina, L-arginina, δ -Hidroxilisina, L-Ornitina, Cistationina, L-Cistina, L-Lisina, L-Valina, L-Metionina, L-Tirosina, L-Homocistina, L-Isoleucina, L-Leucina, L-Fenilanina, L-Triptófano. El análisis de PFAAs se basó en la técnica LC-ESI-MS/MS y el reactivo aTRAQ (Sciex), caracterizado por alta sensibilidad y especificidad, corto tiempo de corrida analítica, bajo volumen de muestra requerido para realizar el análisis y alta cantidad de analitos. siendo cuantificado en una corrida.

Protocolo para la determinación de PFAAs. Se transfirieron muestras de plasma de 40 µl a tubos Eppendorf. Para precipitar las proteínas presentes en el plasma, se añadieron 10 µl de ácido sulfosalicílico al 10% y el contenido se mezcló y centrifugó (10.000 g durante 2 minutos). Posteriormente, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se mezcló con 40 µl de tampón de borato. Una alícuota de 10 µl de la solución obtenida se marcó posteriormente con la solución de reactivo aTRAQ Δ8 (5 µl), se mezcló, se centrifugó y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, la reacción de marcaje se detuvo mediante la adición de 5 µl de hidroxilamina al 1,2 %, se mezcló y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posteriormente, se agregaron 32 µl de la solución del estándar interno y se mezcló el contenido. En el paso siguiente, la muestra se evaporó en un concentrador de vacío durante 15 minutos para reducir el volumen de la muestra a aproximadamente 20 µl. Luego, el residuo se diluyó con 20 µl de agua, se mezcló y se transfirió a un vial de automuestreador con un inserto. Este procedimiento se modificó para medir las concentraciones de PFAA que no se podían detectar con el método original. Para este propósito, se utilizaron muestras de plasma de mayor volumen para el procedimiento de preparación de muestras. En lugar de 40 μl, se transfirieron muestras de plasma de 80 μl a tubos Eppendorf y se mezclaron con 20 μl de ácido sulfosalicílico al 10 %. Posteriormente, se transfirieron 20 μl del sobrenadante a un tubo nuevo y se mezclaron con 30 μl de tampón borato. Los pasos posteriores del procedimiento permanecieron sin cambios. La solución estándar interna contenía los mismos AA marcados con el reactivo aTRAQ Δ0. Así, cada PFAA determinado tenía su correspondiente patrón interno. Se utilizaron norleucina y norvalina, dos AA no proteinogénicos, para evaluar la recuperación y la eficacia del marcaje. Sus patrones internos correspondientes también estaban presentes en la solución de patrón interno.

Los análisis se realizaron utilizando el instrumento de cromatografía líquida 1260 Infinity (Agilent Technologies) acoplado al espectrómetro de masas 4000 QTRAP (trampa de iones de cuadrupolo) (Sciex). Este espectrómetro de masas está equipado con una fuente de ionización por electrospray y tres cuadrupolos y permite realizar el análisis cuantitativo de PFAA previsto en el proyecto presentado. La separación cromatográfica se realizó con la columna de cromatografía Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm). El caudal de las fases móviles se mantuvo a 800 μl/min. El método utiliza las siguientes fases móviles: agua (fase A) y metanol (fase B), ambas con adición de 0,1 % de ácido fórmico y 0,01 % de ácido heptafluorobutírico. El tiempo de análisis fue de 18 minutos y durante ese tiempo se realizó la separación cromatográfica con el siguiente gradiente de elución: de 0 a 6 min - del 2% al 40% de la fase B, luego se mantuvo al 40% de la fase B durante 4 minutos , aumentó al 90% de la fase B hasta los 11 min y se mantuvo en esa relación de fases durante 1 minuto, luego disminuyó al 2% de la fase B y finalmente se mantuvo al 2% de la fase B de 13 a 18 min. El volumen de inyección se fijó en 2 μl y la temperatura de separación en 50 °C. Los ajustes de la fuente de iones fueron los siguientes: cortina de gas 20 psig; voltaje de pulverización de iones 4500 V; temperatura de la fuente de iones 600 °C; gas de fuente de iones 1 = 60 psig, gas de fuente de iones 2 = 50 psig. El espectrómetro de masas operó en modo de ionización positiva y se aplicaron los siguientes parámetros: potencial de entrada = 10 V; potencial de desagrupamiento = 30 V; potencial de salida de la celda de colisión = 5 V; energía de colisión = 30 eV (50 eV en el caso de 7 compuestos); gas de colisión: nitrógeno. Los PFAA se midieron en el modo de monitorización de reacciones múltiples programadas (sMRM). Este modo asegura una alta especificidad y sensibilidad en los análisis cuantitativos. Se realizó una prueba de idoneidad del sistema (análisis de una mezcla estándar de AA) antes de cada lote de muestras para calentar y verificar el rendimiento interdiario de todo el sistema. La adquisición y el procesamiento de datos se realizaron con el software Analyst 1.5 (Sciex). El método LC-ESI-MS/MS descrito para la determinación de AA está bien establecido en el Departamento de Química Inorgánica y Analítica de la Universidad de Ciencias Médicas de Poznan, el coinvestigador del proyecto (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

El hemograma total se realizó con el dispositivo Mythic 18 (Orphée, Suiza). Se extrajeron muestras de sangre capilar de la yema del dedo (20 μl por muestra) simultáneamente con sangre venosa antes, durante y después del ejercicio. La concentración de lactato en sangre se midió utilizando un analizador de línea C (EKF-Diagnostic, Alemania).