Effet de l'adaptation durable à l'entraînement d'endurance et de vitesse sur la concentration d'acides aminés libres plasmatiques (AAdaptation)

I. Objectif de l'étude

Nous avons comparé l'effet à long terme de deux modalités d'entraînement différentes - vitesse-puissance et entraînement d'endurance - sur les modifications de la concentration plasmatique d'acides aminés libres (PFAA) au repos, pendant un exercice progressif jusqu'à l'épuisement et la période de récupération. Nos cohortes modèles étaient des athlètes hautement entraînés. Notre hypothèse était qu'un entraînement structuré de vitesse-puissance et d'endurance de longue durée provoque des adaptations entraînant différentes concentrations d'APFA. Nous avons supposé que les changements dépendent de la spécialisation sportive à long terme (type d'exercice prédominant) et de la phase d'entraînement du cycle d'un an (contribution d'un exercice de haute intensité basé sur un métabolisme anaérobie caractérisé par une dégradation rapide de l'adénosine-5'-triphosphate). Une plus grande contribution d'exercices de haute intensité est utilisée par les athlètes de vitesse et dans les phases de préparation/compétition spécifiques. Il y a un manque de recherche sur les effets à long terme de l'entraînement physique sur les changements dans les APFA. Nous complétons cette image en surveillant les changements dans un ensemble de 42 PFAA protéinogènes et non protéinogènes. Les effets à court et à long terme de l'entraînement sur les niveaux et l'évolution temporelle de la concentration en PFAA pendant l'exercice et la récupération seront démontrés. Les principaux objectifs étaient :

1. Comparer l'effet de deux modalités d'entraînement totalement différentes (vitesse-puissance et endurance) sur la concentration en PFAA.
2. Observer l'effet du caractère de la charge d'entraînement sur les changements de concentration d'APFA au repos, à l'exercice et après l'exercice dans les phases d'entraînement consécutives d'un cycle d'entraînement d'un an.
3. Déterminer le lien entre la concentration en PFAA et la modalité d'exercice, en tenant compte de la masse musculaire squelettique.

II. Fond

Seulement 3 à 6 % de l'énergie totale utilisée pendant un exercice d'endurance prolongé provient de l'oxydation des AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Cependant, la proportion d'énergie provenant du catabolisme des AA augmente considérablement pendant l'exercice (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Bien que le renouvellement des protéines ne contribue pas de manière substantielle à la dépense énergétique, il peut remplir d'autres fonctions importantes pendant l'exercice (Newsholm & Leech 2010). Les AA peuvent retarder l'épuisement du glycogène musculaire (Lemon & Mullin 1980) et soutenir la gluconéogenèse hépatique (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Le pool d'AA libre ne représente que 2 % de la quantité totale d'AA et est stocké dans le plasma et les espaces intra- et extracellulaires. Ce petit pool représente un échange continu d'AA (Wagenmakers 1998). Le plasma sanguin sert de réservoir temporaire d'AA, dont la taille change en réponse à l'exercice. Les différences dans l'entraînement régulier, l'exercice et les activités quotidiennes entraînent des différences dans les niveaux d'APFA (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

La durée de l'exercice affecte les niveaux d'APFA, cependant, la direction des changements peut être différente pour les AA spécifiques et le type, l'intensité et la durée de l'exercice (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie et Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson 1991, Huq et al. 1993, Ishikura et al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). En revanche, la concentration musculaire en AA reste relativement stable (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Le métabolisme des AA pendant un exercice prolongé a été décrit (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Une recherche basée sur une courte période d'entraînement (5 semaines) chez des athlètes de type puissant suggère que les séances d'entraînement de sprint et d'endurance ont un effet distinct sur les AA sériques (Pitkänen 2002b). Cependant, il existe un manque d'études sur les différences dans les changements d'adaptation à long terme des APFA entre les individus entraînés en endurance et en sprint, en tenant compte de plusieurs prélèvements sanguins (repos, exercice, récupération) et de la masse musculaire.

III. Méthodes

Plus de 70 athlètes âgés de 18 à 32 ans - vitesse-puissance (sprinters), endurance (triathlètes, coureurs de fond) et entraînement récréatif - ont été recrutés. Finalement, les données de 58 d'entre eux ont été prises en compte pour analyse. Les athlètes ont été examinés quatre fois au cours d'un cycle d'entraînement d'un an : (1) phase de préparation générale, (2) phase de préparation spécifique, (3) phase de compétition et (4) phase de transition.

Le principal outil statistique était l'ANOVA unidirectionnelle et bidirectionnelle avec mesures répétées. La taille d'échantillon requise a été calculée en fonction du niveau alpha (significativité) donné, de la puissance statistique et de la taille de l'effet. Nous avons supposé le niveau de signification α < 0,05 et la puissance statistique 0,8. Sur la base de nos études antérieures comparant les athlètes entraînés au sprint et à l'endurance en termes d'autres phénomènes métaboliques liés à l'entraînement et à l'exercice (Zieliński, Kusy 2012), un êta carré partiel minimum (η2) de 0,2 a été adopté, c'est-à-dire une grande taille d'effet pour on s'attendait à des différences entre les groupes examinés et à des examens consécutifs. Les autres hypothèses étaient la correction de non-sphéricité = 0,75, le nombre de mesures = 4 et la corrélation entre les mesures répétées = 0,5. La taille minimale de l'échantillon total de 22 athlètes a été obtenue.

La composition corporelle a été évaluée à l'aide d'une double absorptiométrie à rayons X (Lunar Prodigy, GE Healthcare, États-Unis). La masse musculaire squelettique a été estimée à l'aide d'équations de régression (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Des tests d'effort gradués sur un tapis roulant (h/p/cosmos, Allemagne) ont été effectués avant 00 h 00, deux heures après un repas standard. La vitesse initiale était de 8 km/h et augmentait toutes les 3 min de 2 km/h jusqu'à épuisement. Les paramètres respiratoires et la fréquence cardiaque ont été mesurés (ergospiromètre MetaLyzer 3B, Cortex, Allemagne ; Polar Elektro RS 400, Finlande). La consommation maximale d'oxygène a été mesurée.

Prise de sang. Le cathéter veineux périphérique a été placé dans la veine métacarpienne dorsale. Des échantillons de sang ont été prélevés au repos, pendant l'exercice (toutes les 3 min, à chaque changement de vitesse) et immédiatement, 5, 10, 15, 20 et 30 min après la fin de l'exercice. Le volume de sang veineux obtenu lors d'un examen était de 25 ml, soit 2,5 ml pour chaque prélèvement, jusqu'à 10 prélèvements. Chaque échantillon a été recueilli dans un tube de séparation de plasma contenant de l'EDTA pour une analyse ultérieure du plasma. Les échantillons ont été centrifugés à 13 000 tours/min pendant 3 min à 4°C. Le plasma obtenu a ensuite été pipeté dans des flacons de 0,5 ml et immédiatement congelé dans de l'azote liquide. Les échantillons ont été stockés à -80°C jusqu'à l'analyse.

Quarante deux PFAA ont été dosés : O-Phospho-L-sérine, O-Phosphoéthanolamine, Taurine, L-Asparagine, L-Sérine, Hydroxy-L-proline, Glycine, L-Glutamine, Ethanolamine, L-Aspartique, L-Citrulline , Sarcosine, β-alanine, L-alanine, L-thréonine, acide L-glutamique, L-histidine, 1-méthyl-L-histidine, 3-méthyl-L-histidine, L-homocitrulline, acide argininosuccinique, γ-amino -acide n-butyrique, D, acide L-β-aminoisobutyrique, acide L-α-amino-n-butyrique, acide L-α-aminoadipique, L-ansérine, L-carnosine, L-proline, L-arginine, δ -Hydroxylysine, L-Ornithine, Cystationine, L-Cystine, L-Lysine, L-Valine, L-Méthionine, L-Tyrosine, L-Homocystine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Phénylamine, L-Tryptophane. L'analyse des PFAA était basée sur la technique LC-ESI-MS/MS et le réactif aTRAQ (Sciex), caractérisés par une sensibilité et une spécificité élevées, une courte durée d'analyse, un faible volume d'échantillon requis pour effectuer l'analyse et une grande quantité d'analytes. être quantifié en une seule fois.

Protocole de détermination des PFAA. Des échantillons de plasma de 40 ul ont été transférés dans des tubes Eppendorf. Afin de précipiter les protéines présentes dans le plasma, 10 µl d'acide sulfosalicylique à 10 % ont été ajoutés et le contenu a été mélangé et centrifugé (10 000 g pendant 2 minutes). Après cela, le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et mélangé avec 40 µl de tampon borate. Une aliquote de 10 µl de la solution obtenue a ensuite été marquée avec la solution de réactif aTRAQ Δ8 (5 µl), mélangée, centrifugée et incubée à température ambiante pendant 30 minutes. La réaction de marquage a ensuite été stoppée par addition de 5 pl d'hydroxylamine à 1,2 %, mélangée et incubée à température ambiante pendant 15 minutes. Après cela, 32 µl de la solution d'étalon interne ont été ajoutés et le contenu a été mélangé. Dans l'étape suivante, l'échantillon a été évaporé dans un concentrateur sous vide pendant 15 minutes pour réduire le volume de l'échantillon à environ 20 ul. Le résidu a ensuite été dilué avec 20 ul d'eau, mélangé et transféré dans un flacon d'échantillonneur automatique avec un insert. Cette procédure a été modifiée afin de mesurer les concentrations d'APFA non détectables avec la méthode originale. À cette fin, des échantillons de plasma de volume plus élevé ont été utilisés pour la procédure de préparation des échantillons. Au lieu de 40 μl, des échantillons de plasma de 80 μl ont été transférés dans des tubes Eppendorf et mélangés avec 20 μl d'acide sulfosalicylique à 10 %. Après cela, 20 μl du surnageant ont été transférés dans un nouveau tube et mélangés avec 30 μl de tampon borate. Les étapes suivantes de la procédure sont restées inchangées. La solution d'étalon interne contenait les mêmes AA marqués avec le réactif aTRAQ Δ0. Ainsi, chaque PFAA déterminé avait son étalon interne correspondant. La norleucine et la norvaline, deux AA non protéinogènes, ont été utilisées pour évaluer l'efficacité et la récupération du marquage. Leurs étalons internes correspondants étaient également présents dans la solution d'étalon interne.

Les analyses ont été réalisées à l'aide de l'instrument de chromatographie liquide 1260 Infinity (Agilent Technologies) couplé au spectromètre de masse 4000 QTRAP (quadrupole ion trap) (Sciex). Ce spectromètre de masse est équipé d'une source d'ionisation électrospray et de trois quadripôles et permet de réaliser l'analyse quantitative des PFAA prévue dans le cadre du projet présenté. La séparation chromatographique a été réalisée avec la colonne de chromatographie Sciex C18 (5 µm, 4,6 mm x 150 mm). Le débit de phases mobiles a été maintenu à 800 µl/min. La méthode utilise les phases mobiles suivantes: eau (phase A) et méthanol (phase B), toutes deux additionnées de 0,1 % d'acide formique et de 0,01 % d'acide heptafluorobutyrique. Le temps d'analyse était de 18 minutes et pendant ce temps la séparation chromatographique a été réalisée avec le gradient d'élution suivant : de 0 à 6 min - de 2% à 40% de phase B, puis maintenu à 40% de phase B pendant 4 minutes , augmenté à 90 % de la phase B jusqu'à 11 min et maintenu à ce rapport de phases pendant 1 minute, puis diminué à 2 % de la phase B et enfin maintenu à 2 % de la phase B de 13 à 18 min. Le volume d'injection a été fixé à 2 µl et la température de séparation à 50 °C. Les réglages de la source d'ions étaient les suivants : gaz rideau 20 psig ; tension de pulvérisation ionique 4500 V ; température de la source d'ions 600 °C ; gaz source d'ions 1 = 60 psig, gaz source d'ions 2 = 50 psig. Le spectromètre de masse fonctionnait en mode d'ionisation positive et les paramètres suivants étaient appliqués : potentiel d'entrée = 10 V ; potentiel de dégroupage = 30 V ; potentiel de sortie de la cellule de collision = 5 V ; énergie de collision = 30 eV (50 eV dans le cas de 7 composés) ; gaz de collision : azote. Les PFAA ont été mesurés en mode de surveillance programmée des réactions multiples (sMRM). Ce mode garantit une spécificité et une sensibilité élevées dans les analyses quantitatives. Un test d'adéquation du système (analyse d'un mélange standard d'AA) a été effectué avant chaque lot d'échantillons afin de préchauffer et de vérifier les performances inter-journalières de l'ensemble du système. L'acquisition et le traitement des données ont été réalisés à l'aide du logiciel Analyst 1.5 (Sciex). La méthode LC-ESI-MS/MS décrite pour la détermination des AA est bien établie au Département de chimie inorganique et analytique de l'Université des sciences médicales de Poznan, co-investigateur du projet (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

L'hémogramme a été réalisé à l'aide de l'appareil Mythic 18 (Orphée, Suisse). Des échantillons de sang capillaire du bout du doigt (20 μl par échantillon) ont été prélevés simultanément avec du sang veineux avant, pendant et après l'exercice. La concentration de lactate dans le sang a été mesurée à l'aide d'un analyseur C-line (EKF-Diagnostic, Allemagne).