Effekt av langvarig tilpasning til utholdenhet og fartsstyrketrening på plasmafri aminosyrekonsentrasjon (AAdaptation)

I. Studiemål

Vi sammenlignet langtidseffekten av to ulike treningsmodaliteter – hastighet-kraft- og utholdenhetstrening – på endringer i plasmafri aminosyrekonsentrasjon (PFAA) i hvile, under gradert trening inntil utmattelses- og restitusjonsperioden. Våre modellkohorter var høyt trente idrettsutøvere. Vår antagelse var at strukturert langvarig fart-kraft- og utholdenhetstrening forårsaker tilpasninger som resulterer i ulik PFAA-konsentrasjon. Vi antok at endringene avhenger av langvarig idrettsspesialisering (overveiende treningstype) og treningsfase av ettårssyklusen (bidrag av høyintensiv trening basert på anaerob metabolisme preget av rask nedbrytning av adenosin-5'-trifosfat). Et større bidrag fra trening med høy intensitet brukes av speed-power idrettsutøvere og i faser av spesifikk forberedelse/konkurranse. Det mangler forskning på langtidseffekter av fysisk trening på endringer i PFAA. Vi supplerer dette bildet ved å overvåke endringer i et sett med 42 proteinogene og ikke-proteinogene PFAAer. Kort- og langvarige effekter av trening på nivåer og tidsforløp av PFAA-konsentrasjon under trening og restitusjon vil bli vist. Hovedmålene var:

1. For å sammenligne effekten av de to helt forskjellige treningsmodalitetene (hastighetsstyrke og utholdenhet) på PFAA-konsentrasjon.
2. For å observere effekten av treningsbelastningskarakter på endringer i hvile, trening og PFAA-konsentrasjon etter trening i påfølgende treningsfaser av en ettårig treningssyklus.
3. For å bestemme koblingen mellom PFAA-konsentrasjon og treningsmodalitet, tatt i betraktning skjelettmuskelmasse.

II. Bakgrunn

Bare 3-6 % av den totale energien som brukes under langvarig utholdenhetstrening stammer fra oksidasjon av AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Imidlertid øker andelen energi fra AA-katabolisme betraktelig under trening (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Selv om proteinomsetning ikke bidrar vesentlig til energiforbruket, kan det fylle andre viktige funksjoner under trening (Newsholm & Leech 2010). AA-er kan forsinke muskelglykogenutarming (Lemon & Mullin 1980) og støtter hepatisk glukoneogenese (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Den frie AA-poolen utgjør bare 2 % av den totale AA-mengden og lagres i plasma og intra- og ekstracellulære rom. Denne lille poolen står for en kontinuerlig utveksling av AA-er (Wagenmakers 1998). Blodplasma fungerer som et midlertidig reservoar av AA, hvis størrelse endres som respons på trening. Forskjeller i regelmessig trening, mosjon og daglige aktiviteter resulterer i forskjeller i PFAA-nivåer (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

Treningsvarighet påvirker PFAA-nivåer, men retningen på endringene kan være forskjellig for spesifikke AA-er og treningstype, intensitet og varighet (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie and Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson et al. 1991, Hushikurq et al. al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). Derimot forblir muskel-AAs-konsentrasjonen relativt stabil (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

AA-metabolisme under langvarig trening er beskrevet (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). En forskning basert på en kort treningsperiode (5 uker) hos idrettsutøvere av krafttype antyder at sprint- og utholdenhetstreningsøkter har en tydelig effekt på serum AA (Pitkänen 2002b). Det er imidlertid mangel på studier om forskjellene i langsiktige tilpasningsendringer i PFAA mellom utholdenhets- og sprinttrente individer, tatt i betraktning flere blodprøver (hvile, trening, restitusjon) og muskelmasse.

III. Metoder

Over 70 idrettsutøvere i alderen 18-32 år – speed-power (sprintere), utholdenhet (triatleter, distanseløpere) og rekreasjonstrent – ​​ble rekruttert. Til slutt ble dataene til 58 av dem vurdert for analyse. Idrettsutøvere ble undersøkt fire ganger i løpet av ett års treningssyklus: (1) generell forberedelsesfase, (2) spesifikk forberedelsesfase, (3) konkurransefase og (4) overgangsfase.

Det viktigste statistiske verktøyet var enveis og toveis ANOVA med gjentatte mål. Den nødvendige prøvestørrelsen ble beregnet basert på gitt alfa (signifikans) nivå, statistisk styrke og effektstørrelse. Vi antok signifikansnivået α < 0,05 og statistisk styrke 0,8. Basert på våre tidligere studier som sammenlignet sprint- og utholdenhetstrente idrettsutøvere når det gjelder andre metabolske fenomener relatert til trening og trening (Zieliński, Kusy 2012), ble minimum partial eta square (η2) på 0,2 vedtatt, dvs. en stor effektstørrelse for forskjeller mellom undersøkte grupper og påfølgende undersøkelse på tvers var forventet. Andre forutsetninger var ikke-sfærisitetskorreksjon = 0,75, antall målinger = 4, og korrelasjon mellom gjentatte målinger = 0,5. Minste totale prøvestørrelse på 22 idrettsutøvere ble oppnådd.

Kroppssammensetning ble vurdert ved bruk av dobbel røntgenabsorptiometri (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). Skjelettmuskelmassen ble estimert ved bruk av regresjonsligninger (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Graderte treningstester på tredemølle (h/p/cosmos, Tyskland) ble utført før kl. 12.00, to timer etter et standardmåltid. Starthastigheten var 8 km/t og økte hvert 3. minutt med 2 km/t inntil utmattelse. Respirasjonsparametre og hjertefrekvens ble målt (ergospirometer MetaLyzer 3B, Cortex, Tyskland; Polar Elektro RS 400, Finland). Maksimalt oksygenforbruk ble målt.

Blodprøvetaking. Perifert venekateter ble plassert i dorsale metakarpalvene. Blodprøver ble tatt i hvile, under trening (hvert 3. minutt, ved hver hastighetsendring), og umiddelbart, 5, 10, 15, 20 og 30 minutter etter fullført trening. Volumet av veneblod oppnådd under en undersøkelse var 25 ml, dvs. 2,5 ml for hver prøve, opptil 10 prøver. Hver prøve ble samlet inn i plasmaseparasjonsrør som inneholdt EDTA for videre plasmaanalyse. Prøver ble sentrifugert ved 13 000 omdreininger/min i 3 minutter ved 4°C. Oppnådd plasma ble deretter pipettert inn i 0,5 ml ampuller og umiddelbart frosset i flytende nitrogen. Prøver ble lagret i -80°C inntil analyse.

42 PFAAer ble analysert: O-fosfo-L-serin, O-fosfoetanolamin, taurin, L-asparagin, L-serin, hydroksy-L-prolin, glysin, L-glutamin, etanolamin, L-asparaginsyre, L-citrullin , Sarkosin, β-alanin, L-alanin, L-treonin, L-glutaminsyre, L-histidin, 1-metyl-L-histidin, 3-metyl-L-histidin, L-homocitrullin, argininoravsyre, y-amino -n-smørsyre, D, L-β-Aminoisosmørsyre, L-α-Amino-n-smørsyre, L-α- Aminoadipinsyre, L-Anserin, L-karnosin, L-prolin, L-arginin, δ Hydroksylysin, L-Ornitin, Cystationin, L-Cystin, L-Lysin, L-Valin, L-Metionin, L-Tyrosin, L-Homocystin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Fenylanin, L-Tryptofan. Analysen av PFAA-er var basert på LC-ESI-MS/MS-teknikken og aTRAQ (Sciex)-reagenset, karakterisert ved høy sensitivitet og spesifisitet, kort analytisk kjøretid, lavt prøvevolum som kreves for å utføre analysen, og høy mengde analytter kvantifiseres i én kjøring.

Protokoll for bestemmelse av PFAA. Plasmaprøver på 40 ul ble overført til Eppendorf-rør. For å utfelle proteiner tilstede i plasma ble 10 ul 10 % sulfosalisylsyre tilsatt og innholdet ble blandet og sentrifugert (10 000 g i 2 minutter). Deretter ble supernatanten overført til et nytt rør og blandet med 40 ul boratbuffer. En alikvot på 10 µl av den oppnådde løsningen ble deretter merket med aTRAQ-reagens Δ8-løsningen (5 µl), blandet, sentrifugert og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Merkingsreaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 5 ul 1,2 % hydroksylamin, blandet og inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. Deretter ble 32 ul av den interne standardløsningen tilsatt og innholdet ble blandet. I neste trinn ble prøven fordampet i en vakuumkonsentrator i 15 minutter for å redusere volumet av prøven til ca. 20 ul. Resten ble deretter fortynnet med 20 ul vann, blandet og overført til et autosampler-ampulle med en innsats. Denne prosedyren ble modifisert for å måle konsentrasjonene av PFAA som ikke kunne påvises ved bruk av den opprinnelige metoden. For dette formålet ble plasmaprøver med høyere volum brukt til prøveprepareringsprosedyren. I stedet for 40 μl ble plasmaprøver på 80 μl overført til Eppendorf-rør og blandet med 20 μl 10 % sulfosalisylsyre. Deretter ble 20 μl av supernatanten overført til et nytt rør og blandet med 30 μl boratbuffer. De påfølgende trinnene i prosedyren forble uendret. Den interne standardløsningen inneholdt de samme AA-ene merket med aTRAQ-reagenset Δ0. Dermed hadde hver bestemt PFAA sin tilsvarende interne standard. Norleucin og norvalin, to ikke-proteinogene AA-er, ble brukt til å evaluere merkingseffektiviteten og utvinningen. Deres tilsvarende interne standarder var også til stede i den interne standardløsningen.

Analysene ble utført ved bruk av væskekromatografiinstrumentet 1260 Infinity (Agilent Technologies) koblet til 4000 QTRAP (quadrupole ion trap) massespektrometer (Sciex). Dette massespektrometeret er utstyrt med en elektrospray-ioniseringskilde og tre kvadrupoler og gjør det mulig å utføre den kvantitative PFAA-analysen som er planlagt i det presenterte prosjektet. Den kromatografiske separasjonen ble utført med Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) kromatografikolonne. Strømningshastigheten til mobile faser ble holdt på 800 μl/min. Metoden bruker følgende mobile faser: vann (fase A) og metanol (fase B), begge med tilsetning av 0,1 % maursyre og 0,01 % heptafluorsmørsyre. Analysetiden var 18 minutter og i løpet av denne tiden ble den kromatografiske separasjonen utført med følgende gradienteluering: fra 0 til 6 minutter - fra 2 % til 40 % av fase B, deretter holdt ved 40 % av fase B i 4 minutter , økt til 90 % av fase B til 11 minutter og holdt ved dette forholdet fasene i 1 minutt, deretter redusert til 2 % av fase B og til slutt holdt på 2 % av fase B fra 13 til 18 minutter. Injeksjonsvolumet ble satt til 2 μl og separasjonstemperaturen til 50 °C. Ionekildeinnstillingene var følgende: gardingass 20 psig; ionesprayspenning 4500 V; ionekildetemperatur 600 °C; ionekildegass 1 = 60 psig, ionekildegass 2 = 50 psig. Massespektrometeret opererte i positiv ioniseringsmodus og følgende parametere ble brukt: inngangspotensial = 10 V; declustering potensial = 30 V; kollisjonscelleutgangspotensial = 5 V; kollisjonsenergi = 30 eV (50 eV i tilfelle av 7 forbindelser); kollisjonsgass: nitrogen. PFAA-ene ble målt i modus for planlagt multippel reaksjonsovervåking (sMRM). Denne modusen sikrer høy spesifisitet og sensitivitet i kvantitative analyser. En systemegnethetstest (analyse av en standard blanding av AA-er) ble utført før hver gruppe med prøver for å varme opp og kontrollere ytelsen til hele systemet i løpet av dagen. Datainnsamling og prosessering ble utført ved hjelp av Analyst 1.5-programvaren (Sciex). Den beskrevne LC-ESI-MS/MS-metoden for bestemmelse av AA-er er godt etablert i Institutt for uorganisk og analytisk kjemi, Poznan University of Medical Sciences, medetterforskeren av prosjektet (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

Total blodtelling ble utført ved bruk av enheten Mythic 18 (Orphée, Sveits). Kapillærblodprøver fra fingertuppen (20 μl per prøve) ble tatt samtidig med venøst ​​blod før, under og etter trening. Blodlaktatkonsentrasjon ble målt ved bruk av C-line analysator (EKF-Diagnostic, Tyskland).