Effekt af langvarig tilpasning til udholdenhed og hastighedsstyrketræning på plasmafri aminosyrekoncentration (AAdaptation)

I. Studiemål

Vi sammenlignede den langsigtede effekt af to forskellige træningsmodaliteter - speed-power og udholdenhedstræning - på ændringer i plasma fri aminosyre (PFAA) koncentration i hvile, under gradueret træning indtil udmattelse og restitutionsperiode. Vores modelkohorter var højtuddannede atleter. Vores antagelse var, at struktureret langvarig hastigheds-kraft- og udholdenhedstræning forårsager tilpasninger, hvilket resulterer i forskellige PFAA-koncentrationer. Vi antog, at ændringerne afhænger af langvarig sportsspecialisering (overvejende træningstype) og træningsfase af den etårige cyklus (bidrag af højintensiv træning baseret på anaerob metabolisme karakteriseret ved hurtig nedbrydning af adenosin-5'-triphosphat). Et større bidrag fra højintensiv træning bruges af speed-power atleter og i faser af specifik forberedelse/konkurrence. Der mangler forskning i langsigtede effekter af fysisk træning på ændringer i PFAA. Vi supplerer dette billede ved at overvåge ændringer i et sæt af 42 proteinogene og ikke-proteinogene PFAA'er. Kort- og langvarige effekter af træning på niveauer og tidsforløb af PFAA-koncentration under træning og restitution vil blive vist. Hovedmålene var:

1. At sammenligne effekten af ​​de to helt forskellige træningsmodaliteter (hastighed-styrke og udholdenhed) på PFAA-koncentration.
2. At observere effekten af ​​træningsbelastningskarakter på ændringer i hvile, træning og PFAA-koncentration efter træning i på hinanden følgende træningsfaser af en et-årig træningscyklus.
3. For at bestemme sammenhængen mellem PFAA-koncentration og træningsmodalitet under hensyntagen til skeletmuskelmasse.

II. Baggrund

Kun 3-6% af den samlede energi, der bruges under længerevarende udholdenhedstræning, stammer fra oxidation af AA'er (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Andelen af ​​energi fra AA-katabolisme stiger dog betydeligt under træning (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Selvom proteinomsætning ikke bidrager væsentligt til energiforbruget, kan det udfylde andre vigtige funktioner under træning (Newsholm & Leech 2010). AA'er kan forsinke muskelglykogendepletering (Lemon & Mullin 1980) og understøtter hepatisk gluconeogenese (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Den frie AA-pulje udgør kun 2 % af den samlede AA-mængde og opbevares i plasma og intra- og ekstracellulære rum. Denne lille pulje tegner sig for en kontinuerlig udveksling af AA'er (Wagenmakers 1998). Blodplasma tjener som et midlertidigt reservoir af AA'er, hvis størrelse ændres som reaktion på træning. Forskelle i regelmæssig træning, motion og daglige aktiviteter resulterer i forskelle i PFAA-niveauer (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

Træningens varighed påvirker PFAA-niveauerne, men retningen af ​​ændringerne kan være forskellig for specifikke AA'er og træningstype, intensitet og varighed (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie og Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson et al. 1991, Hushikur et al. al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). I modsætning hertil forbliver muskel-AAs-koncentrationen relativt stabil (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

AA-metabolisme under længerevarende træning er blevet beskrevet (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). En undersøgelse baseret på en kort træningsperiode (5 uger) hos atleter af krafttype tyder på, at sprint- og udholdenhedstræningssessioner har en tydelig effekt på serum-AA'er (Pitkänen 2002b). Der mangler dog undersøgelser af forskellene i langsigtede tilpasningsændringer i PFAA'er mellem udholdenheds- og sprinttrænede individer, under hensyntagen til flere blodprøver (hvile, træning, restitution) og muskelmasse.

III. Metoder

Over 70 atleter i alderen 18-32 år - speed-power (sprintere), udholdenhed (triatleter, distanceløbere) og rekreativt trænede - blev rekrutteret. Til sidst blev dataene fra 58 af dem taget i betragtning til analyse. Atleter blev undersøgt fire gange i løbet af et-årig træningscyklus: (1) generel forberedelsesfase, (2) specifik forberedelsesfase, (3) konkurrencefase og (4) overgangsfase.

Det vigtigste statistiske værktøj var en- og to-vejs ANOVA med gentagne målinger. Den krævede stikprøvestørrelse blev beregnet ud fra et givet alfa (signifikans) niveau, statistisk styrke og effektstørrelse. Vi antog signifikansniveauet α < 0,05 og statistisk styrke 0,8. Baseret på vores tidligere undersøgelser, der sammenlignede sprint- og udholdenhedstrænede atleter med hensyn til andre metaboliske fænomener relateret til træning og træning (Zieliński, Kusy 2012), blev minimum partial eta square (η2) på 0,2 vedtaget, dvs. en stor effektstørrelse for forskelle mellem undersøgte grupper og konsekutiv undersøgelse på tværs var forventet. Andre antagelser var nonsfæricitetskorrektion = 0,75, antal målinger = 4 og korrelation mellem gentagne målinger = 0,5. Den mindste samlede prøvestørrelse på 22 atleter blev opnået.

Kropssammensætning blev vurderet ved hjælp af dobbelt røntgenabsorptiometri (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). Skeletmuskelmassen blev estimeret ved hjælp af regressionsligninger (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Graderede træningstests på et løbebånd (h/p/cosmos, Tyskland) blev udført før kl. 12.00, to timer efter et standardmåltid. Starthastigheden var 8 km/t og steg hvert 3. minut med 2 km/t indtil udmattelse. Respirationsparametre og hjertefrekvens blev målt (ergospirometer MetaLyzer 3B, Cortex, Tyskland; Polar Elektro RS 400, Finland). Maksimalt iltforbrug blev målt.

Blodprøvetagning. Perifert venekateter blev anbragt i den dorsale metakarpalvene. Blodprøver blev udtaget i hvile, under træning (hvert 3. minut, ved hver hastighedsændring) og umiddelbart efter 5, 10, 15, 20 og 30 minutter efter endt træning. Volumenet af venøst ​​blod opnået under en undersøgelse var 25 ml, dvs. 2,5 ml for hver prøve, op til 10 prøver. Hver prøve blev opsamlet i plasma-separationsrør indeholdende EDTA til yderligere plasmaanalyse. Prøver blev centrifugeret ved 13.000 omdrejninger/minut i 3 minutter ved 4°C. Opnået plasma blev derefter pipetteret i 0,5 ml hætteglas og straks frosset i flydende nitrogen. Prøver blev opbevaret i -80°C indtil analyse.

Toogfyrre PFAA'er blev analyseret: O-phospho-L-serin, O-phosphoethanolamin, taurin, L-asparagin, L-serin, hydroxy-L-prolin, glycin, L-glutamin, ethanolamin, L-asparaginsyre, L-citrullin , Sarcosin, β-Alanin, L-Alanin, L-Threonin, L-Glutaminsyre, L-Histidin, 1-Methyl-L-histidin, 3-Methyl-L-histidin, L-Homocitrullin, Argininoravsyre, γ-Amino -n-smørsyre, D, L-β-Aminoisosmørsyre, L-α-Amino-n-smørsyre, L-α- Aminoadipinsyre, L-Anserin, L-Carnosin, L-Prolin, L-Arginin, δ -Hydroxylysin, L-Ornithin, Cystathionin, L-Cystin, L-Lysin, L-Valine, L-Methionin, L-Tyrosin, L-Homocystin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Phenylanin, L-Tryptofan. Analysen af ​​PFAA'er var baseret på LC-ESI-MS/MS-teknikken og aTRAQ (Sciex)-reagenset, kendetegnet ved høj sensitivitet og specificitet, kort analytisk kørselstid, lavt prøvevolumen, der kræves for at udføre analysen, og høj mængde analytter kvantificeres i én kørsel.

Protokol til bestemmelse af PFAA'er. Plasmaprøver på 40 µl blev overført til Eppendorf-rør. For at udfælde proteiner til stede i plasma blev 10 µl 10% sulfosalicylsyre tilsat, og indholdet blev blandet og centrifugeret (10.000 g i 2 minutter). Derefter blev supernatanten overført til et nyt rør og blandet med 40 µl boratbuffer. En alikvot på 10 µl af den opnåede opløsning blev efterfølgende mærket med aTRAQ-reagens A8-opløsningen (5 µl), blandet, centrifugeret og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Mærkningsreaktionen blev derefter stoppet ved tilsætning af 5 µl 1,2% hydroxylamin, blandet og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Derefter blev 32 µl af den interne standardopløsning tilsat, og indholdet blev blandet. I det næste trin blev prøven inddampet i en vakuumkoncentrator i 15 minutter for at reducere prøvens volumen til ca. 20 µl. Resten blev derefter fortyndet med 20 µl vand, blandet og overført til et autosampler-hætteglas med en indsats. Denne procedure blev modificeret for at måle koncentrationerne af PFAA'er, der ikke kunne påvises ved hjælp af den oprindelige metode. Til dette formål blev plasmaprøver af større volumen brugt til prøveforberedelsesproceduren. I stedet for 40 μl blev plasmaprøver på 80 μl overført til Eppendorf-rør og blandet med 20 μl 10 % sulfosalicylsyre. Derefter blev 20 μl af supernatanten overført til et nyt rør og blandet med 30 μl boratbuffer. De efterfølgende trin i proceduren forblev uændrede. Den interne standardopløsning indeholdt de samme AA'er mærket med aTRAQ-reagenset Δ0. Således havde hver bestemt PFAA sin tilsvarende interne standard. Norleucin og norvalin, to ikke-proteinogene AA'er, blev brugt til at evaluere mærkningseffektiviteten og genvindingen. Deres tilsvarende interne standarder var også til stede i den interne standardløsning.

Analyserne blev udført under anvendelse af væskekromatografiinstrumentet 1260 Infinity (Agilent Technologies) koblet til 4000 QTRAP (quadrupole ion trap) massespektrometer (Sciex). Dette massespektrometer er udstyret med en elektrospray-ioniseringskilde og tre kvadrupoler og gør det muligt at udføre den kvantitative PFAA-analyse, der er planlagt inden for det præsenterede projekt. Den kromatografiske adskillelse blev udført med Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) kromatografisøjle. Strømningshastigheden af ​​mobile faser blev holdt på 800 μl/min. Metoden anvender følgende mobile faser: vand (fase A) og methanol (fase B), begge med tilsætning af 0,1 % myresyre og 0,01 % heptafluorsmørsyre. Analysetiden var 18 minutter, og i løbet af denne tid blev den kromatografiske adskillelse udført med følgende gradienteluering: fra 0 til 6 minutter - fra 2% til 40% af fase B, derefter holdt ved 40% af fase B i 4 minutter , øget til 90 % af fase B indtil 11 minutter og holdt ved dette forhold faser i 1 minut, derefter faldet til 2 % af fase B og til sidst holdt ved 2 % af fase B fra 13 til 18 minutter. Injektionsvolumenet blev indstillet til 2 μl og separationstemperaturen til 50 °C. Ionkildeindstillingerne var følgende: gardingas 20 psig; ion spray spænding 4500 V; ionkildetemperatur 600 °C; ionkildegas 1 = 60 psig, ionkildegas 2 = 50 psig. Massespektrometeret fungerede i positiv ioniseringstilstand, og følgende parametre blev anvendt: indgangspotentiale = 10 V; declustering potential = 30 V; kollisionscelleudgangspotentiale = 5 V; kollisionsenergi = 30 eV (50 eV i tilfælde af 7 forbindelser); kollisionsgas: nitrogen. PFAA'erne blev målt i planlagt multipel reaktionsovervågning (sMRM) mode. Denne tilstand sikrer høj specificitet og følsomhed i kvantitative analyser. En systemegnethedstest (analyse af en standardblanding af AA'er) blev udført før hver batch af prøver for at varme op og kontrollere hele systemets ydeevne i løbet af dagen. Dataindsamling og -behandling blev udført ved hjælp af Analyst 1.5-softwaren (Sciex). Den beskrevne LC-ESI-MS/MS-metode til bestemmelse af AA'er er veletableret i afdelingen for uorganisk og analytisk kemi, Poznan University of Medical Sciences, co-investigator af projektet (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

Den samlede blodtælling blev udført ved hjælp af enheden Mythic 18 (Orphée, Schweiz). Kapillærblodprøver fra fingerspidsen (20 μl pr. prøve) blev udtaget samtidig med venøst ​​blod før, under og efter træning. Blodlaktatkoncentration blev målt ved anvendelse af C-line analysator (EKF-Diagnostic, Tyskland).