Effect van langdurige aanpassing aan duur- en snelheidstraining op plasmavrije aminozurenconcentratie (AAdaptation)

I. Studiedoel

We vergeleken het langetermijneffect van twee verschillende trainingsmodaliteiten - snelheids-kracht- en duurtraining - op veranderingen in plasmavrije aminozuurconcentratie (PFAA) in rust, tijdens graduele inspanning tot uitputting en herstelperiode. Onze modelcohorten waren hoogopgeleide atleten. Onze veronderstelling was dat gestructureerde langdurige snelheids-kracht- en duurtraining aanpassingen veroorzaken die resulteren in verschillende PFAA-concentraties. We gingen ervan uit dat de veranderingen afhangen van de sportspecialisatie op lange termijn (overheersend trainingstype) en de trainingsfase van de eenjarige cyclus (bijdrage van intensieve training op basis van anaëroob metabolisme gekenmerkt door snelle afbraak van adenosine-5'-trifosfaat). Een grotere bijdrage van intensieve training wordt gebruikt door snelheidsatleten en in fasen van specifieke voorbereiding/wedstrijd. Er is een gebrek aan onderzoek naar langetermijneffecten van fysieke training op veranderingen in PFAA's. We vullen dit beeld aan door veranderingen in een set van 42 proteïnogene en niet-proteïnogene PFAA's te volgen. Korte en langdurige effecten van training op niveaus en tijdsverloop van PFAA-concentratie tijdens inspanning en herstel worden getoond. De belangrijkste doelen waren:

1. Om het effect van de twee totaal verschillende trainingsmodaliteiten (snelheid-kracht en uithoudingsvermogen) op de PFAA-concentratie te vergelijken.
2. Het effect observeren van het karakter van de trainingsbelasting op veranderingen in rust, inspanning en post-inspanning PFAA-concentratie in opeenvolgende trainingsfasen van een eenjarige trainingscyclus.
3. Om het verband tussen PFAA-concentratie en trainingsmodaliteit te bepalen, rekening houdend met de skeletspiermassa.

II. Achtergrond

Slechts 3-6% van de totale energie die tijdens langdurige duurtraining wordt gebruikt, is afkomstig van oxidatie van AA's (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Het aandeel energie uit AA-katabolisme neemt echter aanzienlijk toe tijdens inspanning (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Hoewel de eiwitomzet niet substantieel bijdraagt ​​aan het energieverbruik, kan het tijdens het sporten andere belangrijke functies vervullen (Newsholm & Leech 2010). AA's kunnen de uitputting van spierglycogeen vertragen (Lemon & Mullin 1980) en de hepatische gluconeogenese ondersteunen (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

De vrije AA-voorraad bedraagt ​​slechts 2% van de totale hoeveelheid AA en wordt opgeslagen in het plasma en in de intra- en extracellulaire ruimten. Deze kleine pool zorgt voor een continue uitwisseling van AA's (Wagenmakers 1998). Bloedplasma dient als een tijdelijk reservoir van AA's, waarvan de grootte verandert als reactie op inspanning. Verschillen in regelmatige training, lichaamsbeweging en dagelijkse activiteiten resulteren in verschillen in PFAA-niveaus (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

De duur van de training is van invloed op de PFAA-niveaus, maar de richting van de veranderingen kan verschillen voor specifieke AA's en type training, intensiteit en duur (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie en Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson 1991, Huq et al. 1993, Ishikura et al. al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). De concentratie AA's in de spieren blijft daarentegen relatief stabiel (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Het metabolisme van AA tijdens langdurige inspanning is beschreven (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Een onderzoek gebaseerd op een korte trainingsperiode (5 weken) bij atleten van het krachttype suggereert dat sprint- en duurtrainingssessies een duidelijk effect hebben op serum-AA's (Pitkänen 2002b). Er is echter een gebrek aan studies over de verschillen in aanpassingsveranderingen op lange termijn in PFAA's tussen duur- en sprint-getrainde individuen, rekening houdend met meerdere bloedafnames (rust, inspanning, herstel) en spiermassa.

III. methoden

Meer dan 70 atleten in de leeftijd van 18-32 jaar - snelheidskracht (sprinters), duursporters (triatleten, afstandslopers) en recreatief getrainden - werden gerekruteerd. Uiteindelijk kwamen de gegevens van 58 van hen in aanmerking voor analyse. Atleten werden vier keer onderzocht tijdens een trainingscyclus van een jaar: (1) algemene voorbereidingsfase, (2) specifieke voorbereidingsfase, (3) wedstrijdfase en (4) overgangsfase.

Het belangrijkste statistische hulpmiddel was eenzijdige en tweezijdige ANOVA met herhaalde metingen. De vereiste steekproefomvang werd berekend op basis van het gegeven alfaniveau (significantie), statistisch vermogen en effectgrootte. We gingen uit van het significantieniveau α < 0,05 en statistisch onderscheidingsvermogen 0,8. Op basis van onze eerdere studies waarin sprint- en duurgetrainde atleten werden vergeleken in termen van andere metabole fenomenen gerelateerd aan training en lichaamsbeweging (Zieliński, Kusy 2012), werd een minimale partiële eta-kwadraat (η2) van 0,2 aangenomen, d.w.z. een grote effectgrootte voor verschillen tussen onderzochte groepen en opeenvolgende onderzoeken werden verwacht. Andere aannames waren non-sfericiteitscorrectie = 0,75, aantal metingen = 4 en correlatie tussen herhaalde metingen = 0,5. De minimale totale steekproefomvang van 22 atleten werd verkregen.

De lichaamssamenstelling werd beoordeeld met behulp van dubbele röntgenabsorptiometrie (Lunar Prodigy, GE Healthcare, VS). De skeletspiermassa werd geschat met behulp van regressievergelijkingen (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Graded inspanningstesten op een loopband (h/p/cosmos, Duitsland) werden uitgevoerd vóór 12.00 uur, twee uur na een standaardmaaltijd. De beginsnelheid was 8 km/u en verhoogde elke 3 min met 2 km/u tot uitputting. Ademhalingsparameters en hartslag werden gemeten (ergospirometer MetaLyzer 3B, Cortex, Duitsland; Polar Elektro RS 400, Finland). Het maximale zuurstofverbruik werd gemeten.

Bloedafname. Perifere veneuze katheter werd in dorsale metacarpale ader geplaatst. Bloedmonsters werden afgenomen in rust, tijdens inspanning (elke 3 minuten, bij elke snelheidsverandering) en onmiddellijk, 5, 10, 15, 20 en 30 minuten na voltooiing van de oefening. Het tijdens één onderzoek verkregen volume veneus bloed was 25 ml, d.w.z. 2,5 ml voor elk monster, tot 10 monsters. Elk monster werd verzameld in een plasmascheidingsbuis met EDTA voor verdere plasmaanalyse. Monsters werden gecentrifugeerd bij 13.000 omwentelingen/min gedurende 3 min bij 4°C. Het verkregen plasma werd vervolgens gepipetteerd in flesjes van 0,5 ml en onmiddellijk ingevroren in vloeibare stikstof. Monsters werden tot analyse bewaard bij -80°C.

Tweeënveertig PFAA's werden getest: O-Phospho-L-serine, O-Phosphoethanolamine, Taurine, L-Asparagine, L-Serine, Hydroxy-L-proline, Glycine, L-Glutamine, Ethanolamine, L-Aspartic acid, L-Citrulline , Sarcosine, β-Alanine, L-Alanine, L-Threonine, L-Glutaminezuur, L-Histidine, 1-Methyl-L-histidine, 3-Methyl-L-histidine, L-Homocitrulline, Argininobarnsteenzuur, γ-Amino -n-boterzuur, D, L-β-Aminoisoboterzuur, L-α-Amino-n-boterzuur, L- α- Aminoadipinezuur, L-Anserine, L-Carnosine, L-Proline, L-Arginine, δ -Hydroxylysine, L-Ornithine, Cystathionine, L-Cystine, L-Lysine, L-Valine, L-Methionine, L-Tyrosine, L-Homocystine, L-Isoleucine, L-Leucine, L-Fenylanine, L-Tryptofaan. De analyse van PFAA's was gebaseerd op de LC-ESI-MS/MS-techniek en het aTRAQ (Sciex)-reagens, gekenmerkt door hoge gevoeligheid en specificiteit, korte analytische runtime, laag monstervolume dat nodig is om de analyse uit te voeren, en grote hoeveelheid analyten in één run worden gekwantificeerd.

Protocol voor bepaling van PFAA's. Plasmamonsters van 40 µl werden overgebracht naar Eppendorf-buisjes. Om in plasma aanwezige eiwitten neer te slaan, werd 10 µl 10% sulfosalicylzuur toegevoegd en werd de inhoud gemengd en gecentrifugeerd (10.000 g gedurende 2 minuten). Daarna werd het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis en gemengd met 40 µl boraatbuffer. Een portie van 10 µl van de verkregen oplossing werd vervolgens gemerkt met de aTRAQ-reagens A8-oplossing (5 µl), gemengd, gecentrifugeerd en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De merkingsreactie werd vervolgens gestopt door toevoeging van 5 µl 1,2% hydroxylamine, gemengd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Daarna werd 32 µl van de interne standaardoplossing toegevoegd en werd de inhoud gemengd. In de volgende stap werd het monster gedurende 15 minuten in een vacuümconcentrator verdampt om het volume van het monster terug te brengen tot ongeveer 20 µl. Het residu werd vervolgens verdund met 20 µl water, gemengd en overgebracht naar een autosampler-flesje met een inzetstuk. Deze procedure is aangepast om de concentraties van PFAA's te meten die met de oorspronkelijke methode niet konden worden gedetecteerd. Voor dit doel werden plasmamonsters met een hoger volume gebruikt voor de monstervoorbereidingsprocedure. In plaats van 40 μl werden plasmamonsters van 80 μl overgebracht naar Eppendorf-buisjes en gemengd met 20 μl 10% sulfosalicylzuur. Daarna werd 20 μl van het supernatant overgebracht naar een nieuwe buis en gemengd met 30 μl boraatbuffer. De vervolgstappen van de procedure bleven ongewijzigd. De interne standaardoplossing bevatte dezelfde AA's gelabeld met het aTRAQ-reagens Δ0. Elke bepaalde PFAA had dus zijn overeenkomstige interne standaard. Norleucine en norvaline, twee niet-proteïnogene AA's, werden gebruikt om de labelingsefficiëntie en het herstel te evalueren. Hun corresponderende interne standaarden waren ook aanwezig in de interne standaardoplossing.

De analyses werden uitgevoerd met behulp van het vloeistofchromatografie-instrument 1260 Infinity (Agilent Technologies) gekoppeld aan de 4000 QTRAP (quadrupool ion trap) massaspectrometer (Sciex). Deze massaspectrometer is uitgerust met een electrospray-ionisatiebron en drie quadrupolen en maakt het mogelijk om de geplande kwantitatieve PFAA-analyse uit te voeren binnen het gepresenteerde project. De chromatografische scheiding werd uitgevoerd met de Sciex C18 (5 urn, 4,6 mm x 150 mm) chromatografiekolom. De stroomsnelheid van mobiele fasen werd op 800 μl/min gehouden. De methode maakt gebruik van de volgende mobiele fasen: water (fase A) en methanol (fase B), beide met toevoeging van 0,1 % mierenzuur en 0,01 % heptafluorboterzuur. De analysetijd was 18 minuten en gedurende die tijd werd de chromatografische scheiding uitgevoerd met de volgende gradiëntelutie: van 0 tot 6 min - van 2% tot 40% van fase B, daarna gehandhaafd op 40% van fase B gedurende 4 minuten , verhoogd tot 90% van fase B tot 11 min en in die verhouding fasen gehouden gedurende 1 minuut, vervolgens verlaagd tot 2% van fase B en uiteindelijk gehandhaafd op 2% van fase B van 13 tot 18 min. Het injectievolume werd ingesteld op 2 μl en de scheidingstemperatuur op 50 °C. De ionenbroninstellingen waren als volgt: gordijngas 20 psig; ionensproeispanning 4500 V; ionenbrontemperatuur 600 °C; ionenbrongas 1 = 60 psig, ionenbrongas 2 = 50 psig. De massaspectrometer werkte in positieve ionisatiemodus en de volgende parameters werden toegepast: ingangspotentiaal = 10 V; ontclusteringspotentieel = 30 V; uitgangspotentieel van de botsingscel = 5 V; botsingsenergie = 30 eV (50 eV in het geval van 7 verbindingen); botsingsgas: stikstof. De PFAA's werden gemeten in de geplande modus voor meervoudige reactiebewaking (sMRM). Deze modus zorgt voor een hoge specificiteit en gevoeligheid in kwantitatieve analyses. Een systeemgeschiktheidstest (analyse van een standaardmengsel van AA's) werd uitgevoerd vóór elke batch monsters om op te warmen en de dagelijkse prestaties van het hele systeem te controleren. Gegevensverzameling en -verwerking werden uitgevoerd met behulp van de Analyst 1.5-software (Sciex). De beschreven LC-ESI-MS/MS-methode voor het bepalen van AA's is goed ingeburgerd bij de afdeling Anorganische en analytische chemie, Poznan University of Medical Sciences, de mede-onderzoeker van het project (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

Het totale bloedbeeld werd uitgevoerd met behulp van het apparaat Mythic 18 (Orphée, Swiss). Capillaire bloedmonsters uit de vingertop (20 μl per monster) werden gelijktijdig met veneus bloed voor, tijdens en na de training afgenomen. Bloedlactaatconcentratie werd gemeten met behulp van C-line-analysator (EKF-Diagnostic, Duitsland).