Влияние длительной адаптации к тренировкам на выносливость и скоростную силу на концентрацию свободных аминокислот в плазме (AAdaptation)

I. Цель исследования

Мы сравнили долгосрочный эффект двух разных тренировочных режимов — скоростно-силовых тренировок и тренировок на выносливость — на изменения концентрации свободных аминокислот в плазме (PFAA) в состоянии покоя, во время поэтапных упражнений до истощения и в период восстановления. Наши модельные когорты были хорошо подготовленными спортсменами. Наше предположение заключалось в том, что структурированные длительные тренировки скорости, силы и выносливости вызывают адаптацию, приводящую к различной концентрации ПФАА. Мы предположили, что изменения зависят от длительной спортивной специализации (преобладающий вид физической нагрузки) и тренировочной фазы годичного цикла (вклад высокоинтенсивных физических упражнений на основе анаэробного метаболизма, характеризующегося быстрой деградацией аденозин-5'-трифосфата). Больший вклад высокоинтенсивных упражнений вносят спортсмены, развивающие скоростную силу, и на этапах специальной подготовки/соревнований. Недостаточно исследований долгосрочного влияния физических тренировок на изменения PFAA. Мы дополняем эту картину, отслеживая изменения в наборе из 42 протеиногенных и непротеиногенных ПФАА. Будут показаны краткосрочные и долгосрочные эффекты тренировок на уровни и временной ход концентрации PFAA во время упражнений и восстановления. Основными целями были:

1. Сравнить влияние двух совершенно разных тренировочных модальностей (скорость-сила и выносливость) на концентрацию PFAA.
2. Изучить влияние характера тренировочной нагрузки на изменения концентрации ПФАА в состоянии покоя, нагрузки и после тренировки на последовательных тренировочных этапах годичного тренировочного цикла.
3. Определить связь между концентрацией ПФАА и модальностью физических упражнений с учетом массы скелетных мышц.

II. Задний план

Только 3-6% всей энергии, используемой во время длительных упражнений на выносливость, получают за счет окисления аминокислот (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Однако доля энергии от катаболизма АК значительно возрастает во время упражнений (Ballard & Tomas, 1983; Rennie et al., 1981). Хотя обмен белка не вносит существенного вклада в расход энергии, он может выполнять другие важные функции во время тренировки (Newsholm & Leech 2010). АА могут задерживать истощение мышечного гликогена (Lemon & Mullin 1980) и поддерживать глюконеогенез в печени (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Свободный пул АК составляет всего 2% от общего количества АК и хранится в плазме, внутри- и внеклеточном пространстве. Этот небольшой пул обеспечивает непрерывный обмен АА (Wagenmakers, 1998). Плазма крови служит временным резервуаром АК, размер которых изменяется в ответ на физическую нагрузку. Различия в регулярных тренировках, упражнениях и повседневной деятельности приводят к различиям в уровнях PFAA (Einspahr & Tharp, 1989, Henriksson, 1991, Xiao et al., 2016).

Продолжительность упражнений влияет на уровни PFAA, однако направление изменений может быть различным для конкретных аминокислот и типа упражнений, интенсивности и продолжительности (Ahlborg et al., 1974, Areces et al., 2015, Blomstrand et al., 1988, Blomstrand et al. 1997 г., Боргенвик и др. 2012 г., Кастелл и Ньюсхолм 1988 г., Куизиньер и др. 2001 г., Декомбаз 1979 г., Грэм и др. 1995 г., Хараламби и др. 1976 г., Хассмен и др. 1994 г., Хенрикссон 1991 г., Хук и др. 1993 г., Ишикура и др. и др., 2008 г., Питканен и др., 2002a, Ренни и др., 1981 г., Уорд и др., 1999 г.). Напротив, концентрация аминокислот в мышцах остается относительно стабильной (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Описан метаболизм АК при длительных физических нагрузках (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Одно исследование, основанное на коротком тренировочном периоде (5 недель) у силовых спортсменов, предполагает, что тренировки на спринт и выносливость оказывают разное влияние на уровень аминокислот в сыворотке (Pitkänen 2002b). Тем не менее, недостаточно исследований различий в долгосрочных адаптационных изменениях PFAA между людьми, тренировавшимися на выносливость и спринт, с учетом множественного забора крови (отдых, упражнения, восстановление) и мышечной массы.

III. Методы

Было набрано более 70 спортсменов в возрасте 18-32 лет - скоростно-силовых (спринтеры), выносливости (троеборцы, бегуны на длинные дистанции), оздоровительно-тренированных. В итоге для анализа были взяты данные 58 из них. Спортсменов обследовали четыре раза в течение годичного тренировочного цикла: (1) этап общей подготовки, (2) этап специальной подготовки, (3) этап соревнований и (4) переходный этап.

Основным статистическим инструментом был однофакторный и двусторонний ANOVA с повторными измерениями. Требуемый размер выборки был рассчитан на основе заданного уровня альфа (значительности), статистической мощности и размера эффекта. Мы приняли уровень значимости α < 0,05 и статистическую мощность 0,8. На основании наших более ранних исследований, в которых сравнивались метаболические явления у спортсменов, тренирующихся на спринт и на выносливость, с точки зрения других метаболических явлений, связанных с тренировками и физическими упражнениями (Zieliński, Kusy 2012), был принят минимальный частичный эта-квадрат (η2), равный 0,2, т. е. большой размер эффекта для различия между исследуемыми группами и последовательное обследование между ними было ожидаемым. Другие допущения: поправка на несферичность = 0,75, количество измерений = 4 и корреляция между повторными измерениями = 0,5. Был получен минимальный общий размер выборки в 22 спортсмена.

Состав тела оценивали с помощью двойной рентгеновской абсорбциометрии (Lunar Prodigy, GE Healthcare, США). Массу скелетных мышц оценивали с помощью уравнений регрессии (Kim et al., 2002, Kim et al., 2006).

Тесты с дозированной нагрузкой на беговой дорожке (h/p/cosmos, Германия) проводились до 12:00, через два часа после стандартного приема пищи. Начальная скорость составляла 8 км/ч и увеличивалась каждые 3 мин на 2 км/ч до утомления. Измеряли параметры дыхания и частоту сердечных сокращений (эргоспирометр MetaLyzer 3B, Cortex, Германия; Polar Elektro RS 400, Финляндия). Измеряли максимальное потребление кислорода.

Забор крови. Периферический венозный катетер устанавливали в тыльную пястную вену. Образцы крови брали в покое, во время нагрузки (каждые 3 мин, при каждой смене скорости) и сразу, через 5, 10, 15, 20 и 30 мин после окончания нагрузки. Объем венозной крови, полученный при одном обследовании, составил 25 мл, т.е. по 2,5 мл на каждую пробу, до 10 проб. Каждый образец собирали в пробирку для разделения плазмы, содержащую ЭДТА, для дальнейшего анализа плазмы. Образцы центрифугировали со скоростью 13 000 об/мин в течение 3 мин при 4°С. Затем полученную плазму пипеткой разливали во флаконы по 0,5 мл и сразу же замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при -80°C до проведения анализа.

Было проанализировано сорок два PFAA: O-фосфо-L-серин, O-фосфоэтаноламин, таурин, L-аспарагин, L-серин, гидрокси-L-пролин, глицин, L-глутамин, этаноламин, L-аспарагиновая кислота, L-цитруллин. , Саркозин, β-аланин, L-аланин, L-треонин, L-глутаминовая кислота, L-гистидин, 1-метил-L-гистидин, 3-метил-L-гистидин, L-гомоцитруллин, аргининоянтарная кислота, γ-амино -н-масляная кислота, D, L-β-аминоизомасляная кислота, L-α-амино-н-масляная кислота, L-α-аминоадипиновая кислота, L-ансерин, L-карнозин, L-пролин, L-аргинин, δ -Гидроксилизин, L-орнитин, цистатионин, L-цистин, L-лизин, L-валин, L-метионин, L-тирозин, L-гомоцистин, L-изолейцин, L-лейцин, L-фениланин, L-триптофан. Анализ ПФАА был основан на методе LC-ESI-MS/MS и реагенте aTRAQ (Sciex), характеризующемся высокой чувствительностью и специфичностью, коротким временем проведения анализа, небольшим объемом образца, необходимым для проведения анализа, и большим количеством аналитов. подсчитывается за один прогон.

Протокол определения ПФАА. Образцы плазмы объемом 40 мкл переносили в пробирки Эппендорф. Для осаждения белков, присутствующих в плазме, добавляли 10 мкл 10% сульфосалициловой кислоты, содержимое перемешивали и центрифугировали (10 000 g в течение 2 минут). После этого супернатант переносили в новую пробирку и смешивали с 40 мкл боратного буфера. Затем аликвоту 10 мкл полученного раствора метили раствором реагента aTRAQ Δ8 (5 мкл), перемешивали, центрифугировали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем реакцию мечения останавливали добавлением 5 мкл 1,2% гидроксиламина, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. После этого добавляли 32 мкл раствора внутреннего стандарта и перемешивали содержимое. На следующем этапе образец выпаривали в вакуумном концентраторе в течение 15 минут, чтобы уменьшить объем образца примерно до 20 мкл. Затем остаток разбавляли 20 мкл воды, перемешивали и переносили во флакон автодозатора со вкладышем. Эта процедура была изменена для измерения концентраций ПФАА, которые нельзя было обнаружить с помощью оригинального метода. С этой целью для процедуры пробоподготовки использовали образцы плазмы большего объема. Вместо 40 мкл образцы плазмы объемом 80 мкл переносили в пробирки Эппендорфа и смешивали с 20 мкл 10% сульфосалициловой кислоты. После этого 20 мкл супернатанта переносили в новую пробирку и смешивали с 30 мкл боратного буфера. Последующие этапы процедуры остались без изменений. Раствор внутреннего стандарта содержал те же АК, меченные реагентом aTRAQ Δ0. Таким образом, каждому определяемому ПФАА соответствовал свой внутренний стандарт. Норлейцин и норвалин, две непротеиногенные АК, использовали для оценки эффективности мечения и извлечения. Соответствующие им внутренние стандарты также присутствовали в растворе внутреннего стандарта.

Анализы проводили с использованием прибора для жидкостной хроматографии 1260 Infinity (Agilent Technologies), соединенного с масс-спектрометром 4000 QTRAP (квадрупольная ионная ловушка) (Sciex). Этот масс-спектрометр оснащен источником ионизации электрораспылением и тремя квадруполями и позволяет проводить количественный анализ ПФАА, запланированный в рамках представленного проекта. Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Sciex C18 (5 мкм, 4,6 мм x 150 мм). Скорость потока подвижных фаз поддерживали на уровне 800 мкл/мин. В методе используются следующие подвижные фазы: вода (фаза А) и метанол (фаза Б), обе с добавлением 0,1 % муравьиной кислоты и 0,01 % гептафтормасляной кислоты. Время анализа составило 18 минут и в это время проводили хроматографическое разделение со следующим градиентом элюирования: от 0 до 6 минут - от 2% до 40% фазы Б, затем выдерживали при 40% фазы Б в течение 4 минут. , увеличивали до 90% фазы В до 11 мин и удерживали при таком соотношении фаз в течение 1 минуты, затем уменьшали до 2% фазы В и, наконец, поддерживали на уровне 2% фазы В с 13 до 18 мин. Объем впрыска устанавливали равным 2 мкл, а температуру разделения - 50°С. Настройки ионного источника были следующими: газовая завеса 20 фунтов на кв. дюйм изб.; напряжение ионного распыления 4500 В; температура источника ионов 600 °С; ионный исходный газ 1 = 60 фунтов на кв. дюйм, ионный исходный газ 2 = 50 фунтов на кв. дюйм. Масс-спектрометр работал в режиме положительной ионизации со следующими параметрами: входной потенциал = 10 В; потенциал декластеризации = 30 В; выходной потенциал ячейки столкновений = 5 В; энергия столкновения = 30 эВ (50 эВ в случае 7 соединений); газ столкновения: азот. PFAA измеряли в режиме планового мониторинга множественных реакций (sMRM). Этот режим обеспечивает высокую специфичность и чувствительность при количественном анализе. Тест на пригодность системы (анализ стандартной смеси АК) проводился перед каждой партией образцов с целью прогрева и проверки межсуточной работы всей системы. Сбор и обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Analyst 1.5 (Sciex). Описанный метод LC-ESI-MS/MS для определения АК хорошо зарекомендовал себя на кафедре неорганической и аналитической химии Познанского университета медицинских наук, соисследователя проекта (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Клупчиньска и др., 2016, Матысяк и др., 2014).

Общий анализ крови проводили на аппарате Mythic 18 (Orphée, Швейцария). Образцы капиллярной крови из кончика пальца (20 мкл на образец) брали одновременно с венозной кровью до, во время и после нагрузки. Концентрацию лактата в крови измеряли с помощью анализатора С-линии (EKF-Diagnostic, Германия).