Wpływ długotrwałej adaptacji do treningu wytrzymałościowego i szybkościowo-siłowego na stężenie wolnych aminokwasów w osoczu (AAdaptation)

I. Cel nauki

Porównaliśmy długoterminowy wpływ dwóch różnych rodzajów treningu – treningu szybkościowo-siłowego i wytrzymałościowego – na zmiany stężenia wolnych aminokwasów (PFAA) w osoczu w spoczynku, podczas stopniowanych ćwiczeń aż do wyczerpania i okresu regeneracji. Nasze modelowe kohorty były dobrze wyszkolonymi sportowcami. Założyliśmy, że ustrukturyzowany, długotrwały trening szybkościowo-siłowy i wytrzymałościowy powoduje adaptacje skutkujące różnymi stężeniami PFAA. Przyjęliśmy, że zmiany te zależą od wieloletniej specjalizacji sportowej (dominujący typ ćwiczeń) oraz fazy treningowej cyklu rocznego (wkład ćwiczeń o wysokiej intensywności opartych na metabolizmie beztlenowym charakteryzującym się szybką degradacją adenozyno-5'-trifosforanu). Większy udział ćwiczeń o wysokiej intensywności jest stosowany przez sportowców szybkościowo-siłowych oraz w fazach określonych przygotowań/zawodów. Brakuje badań dotyczących długoterminowego wpływu treningu fizycznego na zmiany PFAA. Uzupełniamy ten obraz, monitorując zmiany w zestawie 42 proteinogennych i niebiałkowych PFAA. Przedstawione zostaną krótko- i długoterminowe efekty treningu na poziomy i przebiegi czasowe stężenia PFAA podczas wysiłku i regeneracji. Głównymi celami były:

1. Porównanie wpływu dwóch całkowicie różnych metod treningu (szybkość-moc i wytrzymałość) na stężenie PFAA.
2. Obserwacja wpływu charakteru obciążenia treningowego na zmiany spoczynkowego, wysiłkowego i powysiłkowego stężenia PFAA w kolejnych fazach treningowych rocznego cyklu treningowego.
3. Określenie związku pomiędzy stężeniem PFAA a rodzajem wysiłku z uwzględnieniem masy mięśni szkieletowych.

II. Tło

Tylko 3-6% całkowitej energii zużywanej podczas długotrwałych ćwiczeń wytrzymałościowych pochodzi z utleniania AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe i in. 1984). Jednak udział energii pochodzącej z katabolizmu AA znacznie wzrasta podczas ćwiczeń (Ballard i Tomas 1983, Rennie i in. 1981). Chociaż obrót białkami nie przyczynia się znacząco do wydatku energetycznego, może pełnić inne ważne funkcje podczas ćwiczeń (Newsholm i Leech 2010). AA mogą opóźniać wyczerpanie glikogenu mięśniowego (Lemon i Mullin 1980) oraz wspomagać glukoneogenezę w wątrobie (Ahlborg i wsp. 1974, Ahlborg i Felig 1982, Felig i Wahren 1971).

Wolna pula AA stanowi zaledwie 2% całkowitej ilości AA i jest magazynowana w osoczu oraz przestrzeniach wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych. Ta niewielka pula odpowiada za ciągłą wymianę AA (Wagenmakers 1998). Osocze krwi służy jako tymczasowy rezerwuar AA, których wielkość zmienia się w odpowiedzi na wysiłek fizyczny. Różnice w regularnych treningach, ćwiczeniach i codziennych czynnościach skutkują różnicami w poziomach PFAA (Einspahr i Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao i in. 2016).

Czas trwania ćwiczeń wpływa na poziom PFAA, jednak kierunek zmian może być różny dla poszczególnych AA oraz rodzaju ćwiczeń, intensywności i czasu trwania (Ahlborg i wsp. 1974, Areces i wsp. 2015, Blomstrand i wsp. 1988, Blomstrand i wsp. 1997, Borgenvik i wsp. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier i wsp. 2001, Decombaz 1979, Graham i wsp. 1995, Haralambie i Berg 1976, Hassmén i wsp. 1994, Henriksson 1991, Huq i wsp. 1993, Ishikura i wsp. wsp. 2008, Pitkänen i wsp. 2002a, Rennie i wsp. 1981, Ward i wsp. 1999). Natomiast stężenie AA w mięśniach pozostaje względnie stabilne (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Opisano metabolizm AA podczas długotrwałych ćwiczeń (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Jedno badanie oparte na krótkim okresie treningowym (5 tygodni) u sportowców typu siłowego sugeruje, że sesje treningu sprinterskiego i wytrzymałościowego mają wyraźny wpływ na AA w surowicy (Pitkänen 2002b). Brakuje jednak badań dotyczących różnic w długoterminowych zmianach adaptacyjnych w PFAA między osobami trenującymi wytrzymałość i sprint, biorąc pod uwagę wielokrotne pobieranie krwi (odpoczynek, ćwiczenia, regeneracja) i masę mięśniową.

III. Metody

Zrekrutowano ponad 70 sportowców w wieku 18-32 lat - szybkościowo-siłowych (sprinterzy), wytrzymałościowych (triathloniści, biegacze długodystansowi) oraz trenujących rekreacyjnie. Ostatecznie do analizy wzięto pod uwagę dane 58 z nich. Zawodnicy byli badani czterokrotnie podczas rocznego cyklu treningowego: (1) faza przygotowawcza ogólna, (2) faza przygotowawcza szczegółowa, (3) faza zawodów oraz (4) faza przejściowa.

Głównym narzędziem statystycznym była jednokierunkowa i dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami. Wymaganą wielkość próby obliczono na podstawie danego poziomu alfa (istotności), mocy statystycznej i wielkości efektu. Przyjęliśmy poziom istotności α < 0,05 i moc statystyczną 0,8. Na podstawie naszych wcześniejszych badań porównujących sportowców trenujących sprint i wytrzymałość pod kątem innych zjawisk metabolicznych związanych z treningiem i wysiłkiem fizycznym (Zieliński, Kusy 2012) przyjęto minimalny częściowy eta kwadrat (η2) równy 0,2, czyli dużą wielkość efektu dla spodziewano się różnic między badanymi grupami i kolejnych badań w poprzek. Inne założenia to poprawka na niesferyczność = 0,75, liczba pomiarów = 4 i korelacja między powtarzanymi pomiarami = 0,5. Uzyskano minimalną łączną wielkość próby 22 sportowców.

Skład ciała oceniano za pomocą podwójnej absorpcjometrii rentgenowskiej (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). Masę mięśni szkieletowych oszacowano za pomocą równań regresji (Kim i in. 2002, Kim i in. 2006).

Stopniowane próby wysiłkowe na bieżni (h/p/cosmos, Niemcy) przeprowadzono przed godziną 12:00, dwie godziny po standardowym posiłku. Prędkość początkowa wynosiła 8 km/h i zwiększała się co 3 min o 2 km/h aż do wyczerpania. Mierzono parametry oddechowe i częstość akcji serca (ergospirometr MetaLyzer 3B, Cortex, Niemcy; Polar Elektro RS 400, Finlandia). Zmierzono maksymalne zużycie tlenu.

Pobieranie próbek krwi. Obwodowy cewnik żylny wprowadzano do żyły grzbietowej śródręcza. Próbki krwi pobierano w spoczynku, podczas wysiłku (co 3 minuty, przy każdej zmianie prędkości) oraz bezpośrednio po 5, 10, 15, 20 i 30 minutach od zakończenia wysiłku. Objętość krwi żylnej uzyskanej podczas jednego badania wynosiła 25 ml, tj. 2,5 ml na każdą próbkę, do 10 próbek. Każdą próbkę zebrano do probówki do separacji osocza zawierającej EDTA do dalszej analizy osocza. Próbki wirowano przy 13 000 obrotów/min przez 3 min w 4°C. Otrzymane osocze następnie odpipetowano do 0,5 ml fiolek i natychmiast zamrożono w ciekłym azocie. Próbki przechowywano w temperaturze -80°C do czasu analizy.

Zbadano czterdzieści dwa PFAA: O-fosfo-L-seryna, O-fosfoetanoloamina, tauryna, L-asparagina, L-seryna, hydroksy-L-prolina, glicyna, L-glutamina, etanoloamina, kwas L-asparaginowy, L-cytrulina , Sarkozyna, β-alanina, L-alanina, L-treonina, L-kwas glutaminowy, L-histydyna, 1-metylo-L-histydyna, 3-metylo-L-histydyna, L-homocytrulina, kwas argininobursztynowy, γ-amino Kwas -n-masłowy, D, Kwas L-β-aminoizomasłowy, Kwas L-α-amino-n-masłowy, Kwas L-α-aminoadypinowy, L-Anseryna, L-Karnozyna, L-Prolina, L-Arginina, δ -Hydroksylizyna, L-ornityna, cystationina, L-cystyna, L-lizyna, L-walina, L-metionina, L-tyrozyna, L-homocystyna, L-izoleucyna, L-leucyna, L-fenylanina, L-tryptofan. Analiza PFAA została przeprowadzona w oparciu o technikę LC-ESI-MS/MS oraz odczynnik aTRAQ (Sciex), charakteryzujący się wysoką czułością i specyficznością, krótkim czasem pracy analitycznej, małą objętością próbki potrzebną do wykonania analizy oraz dużą ilością analitów ilościowo w jednym przebiegu.

Protokół oznaczania PFAA. Próbki osocza po 40 ul przeniesiono do probówek Eppendorfa. W celu wytrącenia białek obecnych w osoczu dodano 10 µl 10% kwasu sulfosalicylowego, zawartość mieszano i wirowano (10 000 g przez 2 minuty). Następnie supernatant przeniesiono do nowej probówki i zmieszano z 40 ul buforu boranowego. Porcję 10 µl otrzymanego roztworu następnie znakowano roztworem odczynnika aTRAQ ∆8 (5 µl), mieszano, odwirowywano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie reakcję znakowania zatrzymano przez dodanie 5 ul 1,2% hydroksyloaminy, wymieszano i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie dodano 32 µl wewnętrznego roztworu wzorcowego i zawartość mieszano. W kolejnym etapie próbkę odparowywano w koncentratorze próżniowym przez 15 minut w celu zmniejszenia objętości próbki do około 20 µl. Pozostałość następnie rozcieńczono 20 µl wody, wymieszano i przeniesiono do fiolki autosamplera z wkładką. Procedura ta została zmodyfikowana w celu pomiaru stężeń PFAA, których nie można było wykryć przy użyciu oryginalnej metody. W tym celu do procedury przygotowania próbek wykorzystano próbki osocza o większej objętości. Zamiast 40 μl próbki osocza o objętości 80 μl przeniesiono do probówek Eppendorfa i zmieszano z 20 μl 10% kwasu sulfosalicylowego. Następnie 20 μl supernatantu przeniesiono do nowej probówki i zmieszano z 30 μl buforu boranowego. Dalsze etapy postępowania pozostały bez zmian. Wewnętrzny roztwór wzorcowy zawierał te same AA znakowane odczynnikiem aTRAQ Δ0. Zatem każdy określony PFAA miał swój odpowiedni wewnętrzny standard. Norleucyna i norwalina, dwa niebiałkowe AA, zostały użyte do oceny wydajności znakowania i odzyskiwania. Odpowiednie wzorce wewnętrzne były również obecne w wewnętrznym roztworze wzorcowym.

Analizy przeprowadzono stosując instrument do chromatografii cieczowej 1260 Infinity (Agilent Technologies) sprzężony ze spektrometrem mas 4000 QTRAP (kwadrupolowa pułapka jonowa) (Sciex). Spektrometr masowy wyposażony w źródło jonizacji przez elektrorozpylanie oraz trzy kwadrupole pozwala na przeprowadzenie ilościowej analizy PFAA zaplanowanej w ramach prezentowanego projektu. Rozdzielanie chromatograficzne przeprowadzono na kolumnie chromatograficznej Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm). Szybkość przepływu faz ruchomych utrzymywano na poziomie 800 μl/min. Metoda wykorzystuje następujące fazy ruchome: wodę (faza A) i metanol (faza B), obie z dodatkiem 0,1% kwasu mrówkowego i 0,01% kwasu heptafluoromasłowego. Czas analizy wynosił 18 minut iw tym czasie prowadzono rozdział chromatograficzny z następującym gradientem elucji: od 0 do 6 min - od 2% do 40% fazy B, następnie utrzymywano 40% fazy B przez 4 minuty , wzrosła do 90% fazy B do 11 min i utrzymywała ten stosunek faz przez 1 minutę, następnie spadła do 2% fazy B i ostatecznie utrzymywała się na poziomie 2% fazy B od 13 do 18 min. Objętość nastrzyku ustawiono na 2 μl, a temperaturę rozdzielania na 50°C. Ustawienia źródła jonów były następujące: gaz osłonowy 20 psig; napięcie rozpylania jonów 4500 V; temperatura źródła jonów 600°C; źródło jonów gaz 1 = 60 psig, źródło jonów gaz 2 = 50 psig. Spektrometr masowy pracował w trybie jonizacji dodatniej i stosowano następujące parametry: potencjał wejściowy = 10 V; potencjał deklastrowania = 30 V; potencjał wyjściowy komórki kolizyjnej = 5 V; energia zderzenia = 30 eV (50 eV w przypadku 7 związków); gaz kolizyjny: azot. PFAA mierzono w trybie zaplanowanego monitorowania wielu reakcji (sMRM). Tryb ten zapewnia wysoką specyficzność i czułość w analizach ilościowych. Przed każdą partią próbek przeprowadzano test przydatności systemu (analiza standardowej mieszaniny AA) w celu rozgrzania i sprawdzenia pracy całego systemu w ciągu dnia. Akwizycję i przetwarzanie danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Analyst 1.5 (Sciex). Opisana metoda LC-ESI-MS/MS do oznaczania AA jest dobrze ugruntowana w Zakładzie Chemii Nieorganicznej i Analitycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu, współwykonawcy projektu (Dereziński i in. 2017, Hajduk i in. 2015, Klupczyńska i in. 2016, Matysiak i in. 2014).

Morfologię całkowitą wykonano aparatem Mythic 18 (Orphée, Szwajcaria). Próbki krwi włośniczkowej z opuszki palca (20 μl na próbkę) pobierano jednocześnie z krwią żylną przed, w trakcie i po wysiłku. Stężenie mleczanu we krwi mierzono za pomocą analizatora linii C (EKF-Diagnostic, Niemcy).