Effetto dell'adattamento duraturo all'allenamento di resistenza e velocità-potenza sulla concentrazione di aminoacidi liberi nel plasma (AAdaptation)

I. Obiettivo dello studio

Abbiamo confrontato l'effetto a lungo termine di due diverse modalità di allenamento - velocità-potenza e allenamento di resistenza - sui cambiamenti nella concentrazione di aminoacidi liberi nel plasma (PFAA) a riposo, durante l'esercizio graduale fino all'esaurimento e al periodo di recupero. Le nostre coorti modello erano atleti altamente allenati. La nostra ipotesi era che l'allenamento strutturato di velocità-potenza e resistenza di lunga durata causasse adattamenti con conseguenti diverse concentrazioni di PFAA. Abbiamo ipotizzato che i cambiamenti dipendano dalla specializzazione sportiva a lungo termine (tipo di esercizio predominante) e dalla fase di allenamento del ciclo di un anno (contributo dell'esercizio ad alta intensità basato sul metabolismo anaerobico caratterizzato da una rapida degradazione dell'adenosina-5'-trifosfato). Un maggior apporto di esercizio ad alta intensità viene utilizzato dagli atleti velocità-potenza e nelle fasi di preparazione/gara specifica. C'è una mancanza di ricerca sugli effetti a lungo termine dell'allenamento fisico sui cambiamenti nei PFAA. Integriamo questa immagine monitorando i cambiamenti in un set di 42 PFAA proteinogenici e non proteinogenici. Verranno mostrati gli effetti di breve e lunga durata dell'allenamento sui livelli e sull'andamento temporale della concentrazione di PFAA durante l'esercizio e il recupero. Gli obiettivi principali erano:

1. Confrontare l'effetto delle due modalità di allenamento completamente diverse (velocità-potenza e resistenza) sulla concentrazione di PFAA.
2. Osservare l'effetto del carattere del carico di allenamento sui cambiamenti nella concentrazione di PFAA a riposo, esercizio e post-esercizio in fasi di allenamento consecutive di un ciclo di allenamento di un anno.
3. Determinare il legame tra concentrazione di PFAA e modalità di esercizio, tenendo conto della massa muscolare scheletrica.

II. Sfondo

Solo il 3-6% dell'energia totale utilizzata durante l'esercizio di resistenza prolungato deriva dall'ossidazione degli AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Tuttavia, la proporzione di energia dal catabolismo AA aumenta considerevolmente durante l'esercizio (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Sebbene il turnover proteico non contribuisca in modo sostanziale al dispendio energetico, può svolgere altre importanti funzioni durante l'esercizio (Newsholm & Leech 2010). Gli AA possono ritardare la deplezione del glicogeno muscolare (Lemon & Mullin 1980) e sostenere la gluconeogenesi epatica (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Il pool di AA liberi ammonta solo al 2% della quantità totale di AA ed è immagazzinato nel plasma e negli spazi intra ed extracellulari. Questo piccolo pool rappresenta un continuo scambio di AA (Wagenmakers 1998). Il plasma sanguigno funge da serbatoio temporaneo di AA, la cui dimensione cambia in risposta all'esercizio. Le differenze nell'allenamento regolare, nell'esercizio e nelle attività quotidiane si traducono in differenze nei livelli di PFAA (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

La durata dell'esercizio influisce sui livelli di PFAA, tuttavia, la direzione dei cambiamenti può essere diversa per specifici AA e tipo di esercizio, intensità e durata (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik e altri 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier e altri 2001, Decombaz 1979, Graham e altri 1995, Haralambie e Berg 1976, Hassmén e altri 1994, Henriksson 1991, Huq e altri 1993, Ishikura e altri al.2008, Pitkänen et al.2002a, Rennie et al.1981, Ward et al.1999). Al contrario, la concentrazione di AA muscolari rimane relativamente stabile (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

È stato descritto il metabolismo degli AA durante l'esercizio prolungato (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Una ricerca basata su un breve periodo di allenamento (5 settimane) in atleti di potenza suggerisce che le sessioni di allenamento di sprint e resistenza hanno un effetto distinto sugli AA sierici (Pitkänen 2002b). Tuttavia, mancano studi sulle differenze nei cambiamenti di adattamento a lungo termine nei PFAA tra individui allenati per la resistenza e per lo sprint, tenendo conto di più prelievi di sangue (riposo, esercizio, recupero) e della massa muscolare.

III. Metodi

Sono stati reclutati oltre 70 atleti di età compresa tra 18 e 32 anni: velocità-potenza (velocisti), resistenza (triatleti, fondisti) e allenamenti ricreativi. Alla fine, i dati di 58 di loro sono stati presi in considerazione per l'analisi. Gli atleti sono stati esaminati quattro volte durante il ciclo di allenamento di un anno: (1) fase di preparazione generale, (2) fase di preparazione specifica, (3) fase di competizione e (4) fase di transizione.

Il principale strumento statistico era l'ANOVA unidirezionale e bidirezionale con misure ripetute. La dimensione del campione richiesta è stata calcolata in base a un determinato livello alfa (significanza), potenza statistica e dimensione dell'effetto. Abbiamo assunto il livello di significatività α <0,05 e il potere statistico 0,8. Sulla base dei nostri studi precedenti che hanno confrontato gli atleti allenati con sprint e resistenza in termini di altri fenomeni metabolici correlati all'allenamento e all'esercizio (Zieliński, Kusy 2012), è stato adottato un eta quadrato minimo parziale (η2) di 0,2, ovvero una grande dimensione dell'effetto per erano previste differenze tra i gruppi esaminati e l'esame consecutivo. Altre ipotesi erano la correzione della non sfericità = 0,75, il numero di misurazioni = 4 e la correlazione tra misurazioni ripetute = 0,5. È stata ottenuta la dimensione minima del campione totale di 22 atleti.

La composizione corporea è stata valutata utilizzando la doppia assorbimetria a raggi X (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). La massa muscolare scheletrica è stata stimata utilizzando equazioni di regressione (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

I test di esercizio graduato su un tapis roulant (h/p/cosmos, Germania) sono stati condotti prima delle 12:00, due ore dopo un pasto standard. La velocità iniziale era di 8 km/he aumentava ogni 3 min di 2 km/h fino all'esaurimento. Sono stati misurati i parametri respiratori e la frequenza cardiaca (ergospirometro MetaLyzer 3B, Cortex, Germania; Polar Elektro RS 400, Finlandia). È stato misurato il consumo massimo di ossigeno.

Prelievo di sangue. Il catetere venoso periferico è stato inserito nella vena metacarpale dorsale. I campioni di sangue sono stati prelevati a riposo, durante l'esercizio (ogni 3 minuti, ad ogni cambio di velocità) e immediatamente, 5, 10, 15, 20 e 30 minuti dopo il completamento dell'esercizio. Il volume di sangue venoso ottenuto durante un esame era di 25 ml, cioè 2,5 ml per ciascun campione, fino a 10 campioni. Ogni campione è stato raccolto in una provetta per la separazione del plasma contenente EDTA per un'ulteriore analisi del plasma. I campioni sono stati centrifugati a 13.000 giri/min per 3 minuti a 4°C. Il plasma ottenuto è stato quindi pipettato in fiale da 0,5 ml e congelato immediatamente in azoto liquido. I campioni sono stati conservati a -80°C fino all'analisi.

Sono stati dosati quarantadue PFAA: O-fosfo-L-serina, O-fosfoetanolammina, taurina, L-asparagina, L-serina, idrossi-L-prolina, glicina, L-glutammina, etanolamina, acido L-aspartico, L-citrullina , Sarcosina, β-alanina, L-alanina, L-treonina, acido L-glutammico, L-istidina, 1-metil-L-istidina, 3-metil-L-istidina, L-omocitrullina, acido arginosuccinico, γ-ammino -n-acido butirrico, D, acido L-β-amminoisobutirrico, acido L-α-ammino-n-butirrico, acido L-α-amminoadipico, L-anserina, L-carnosina, L-prolina, L-arginina, δ -Idrossilisina, L-Ornitina, Cistationina, L-Cistina, L-Lisina, L-Valina, L-Metionina, L-Tirosina, L-Omocistina, L-Isoleucina, L-Leucina, L-Fenilanina, L-Triptofano. L'analisi dei PFAA si è basata sulla tecnica LC-ESI-MS/MS e sul reagente aTRAQ (Sciex), caratterizzati da elevata sensibilità e specificità, breve tempo di esecuzione analitica, basso volume di campione necessario per eseguire l'analisi ed elevata quantità di analiti essere quantificato in una corsa.

Protocollo per la determinazione dei PFAA. Campioni di plasma di 40 µl sono stati trasferiti in provette Eppendorf. Per precipitare le proteine ​​presenti nel plasma sono stati aggiunti 10 µl di acido solfosalicilico al 10% e il contenuto è stato miscelato e centrifugato (10.000 g per 2 minuti). Successivamente, il surnatante è stato trasferito in una nuova provetta e miscelato con 40 µl di tampone borato. Un'aliquota di 10 µl della soluzione ottenuta è stata successivamente marcata con la soluzione di reagente aTRAQ Δ8 (5 µl), miscelata, centrifugata e incubata a temperatura ambiente per 30 minuti. La reazione di marcatura è stata quindi arrestata mediante l'aggiunta di 5 µl di idrossilammina all'1,2%, miscelata e incubata a temperatura ambiente per 15 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 32 µl della soluzione standard interna e il contenuto è stato miscelato. Nella fase successiva, il campione è stato evaporato in un concentratore sotto vuoto per 15 minuti per ridurre il volume del campione a circa 20 µl. Il residuo è stato quindi diluito con 20 µl di acqua, miscelato e trasferito in una fiala per autocampionatore con un inserto. Questa procedura è stata modificata per misurare le concentrazioni di PFAA che non potevano essere rilevate utilizzando il metodo originale. A tale scopo, per la procedura di preparazione del campione sono stati utilizzati campioni di plasma di volume maggiore. Invece di 40 μl, campioni di plasma di 80 μl sono stati trasferiti in provette Eppendorf e miscelati con 20 μl di acido solfosalicilico al 10%. Successivamente, 20 μl del surnatante sono stati trasferiti in una nuova provetta e miscelati con 30 μl di tampone borato. Le successive fasi della procedura sono rimaste invariate. La soluzione standard interna conteneva gli stessi AA marcati con il reagente aTRAQ Δ0. Pertanto, ogni PFAA determinato aveva il suo standard interno corrispondente. Norleucina e norvalina, due AA non proteinogenici, sono state utilizzate per valutare l'efficienza e il recupero dell'etichettatura. I loro standard interni corrispondenti erano presenti anche nella soluzione standard interna.

Le analisi sono state eseguite utilizzando lo strumento di cromatografia liquida 1260 Infinity (Agilent Technologies) accoppiato allo spettrometro di massa 4000 QTRAP (quadrupole ion trap) (Sciex). Questo spettrometro di massa è dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray e tre quadrupoli e consente di condurre l'analisi quantitativa PFAA pianificata nell'ambito del progetto presentato. La separazione cromatografica è stata eseguita con la colonna cromatografica Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm). La portata delle fasi mobili è stata mantenuta a 800 μl/min. Il metodo utilizza le seguenti fasi mobili: acqua (fase A) e metanolo (fase B), entrambe addizionate di acido formico allo 0,1% e di acido eptafluorobutirrico allo 0,01%. Il tempo di analisi è stato di 18 minuti e durante questo tempo è stata effettuata la separazione cromatografica con il seguente gradiente di eluizione: da 0 a 6 min - dal 2% al 40% di fase B, quindi mantenuto al 40% di fase B per 4 minuti , aumentato al 90% della fase B fino a 11 min e mantenuto a quel rapporto fasi per 1 minuto, poi diminuito al 2% della fase B e infine mantenuto al 2% della fase B da 13 a 18 min. Il volume di iniezione è stato fissato a 2 μl e la temperatura di separazione a 50 °C. Le impostazioni della sorgente ionica erano le seguenti: curtain gas 20 psig; tensione di spruzzo ionico 4500 V; temperatura della sorgente ionica 600 °C; gas sorgente ionica 1 = 60 psig, gas sorgente ionica 2 = 50 psig. Lo spettrometro di massa ha funzionato in modalità di ionizzazione positiva e sono stati applicati i seguenti parametri: potenziale di ingresso = 10 V; potenziale di declustering = 30 V; potenziale di uscita della cella di collisione = 5 V; energia di collisione = 30 eV (50 eV nel caso di 7 composti); gas di collisione: azoto. I PFAA sono stati misurati in modalità di monitoraggio di reazioni multiple programmate (sMRM). Questa modalità garantisce un'elevata specificità e sensibilità nelle analisi quantitative. Prima di ogni lotto di campioni è stato condotto un test di idoneità del sistema (analisi di una miscela standard di AA) per riscaldare e controllare le prestazioni infragiornaliere dell'intero sistema. L'acquisizione e l'elaborazione dei dati sono state eseguite utilizzando il software Analyst 1.5 (Sciex). Il metodo LC-ESI-MS/MS descritto per la determinazione degli AA è ben consolidato presso il Dipartimento di chimica inorganica e analitica dell'Università di scienze mediche di Poznan, co-ricercatore del progetto (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska e altri 2016, Matysiak e altri 2014).

L'emocromo totale è stato eseguito utilizzando il dispositivo Mythic 18 (Orphée, Svizzera). I campioni di sangue capillare dalla punta delle dita (20 μl per campione) sono stati prelevati contemporaneamente al sangue venoso prima, durante e dopo l'esercizio. La concentrazione di lattato nel sangue è stata misurata utilizzando l'analizzatore C-line (EKF-Diagnostic, Germania).