Efeito da Adaptação Duradoura ao Treinamento de Resistência e Força de Velocidade na Concentração de Aminoácidos Livres no Plasma (AAdaptation)

I. Objetivo do estudo

Comparamos o efeito a longo prazo de duas modalidades de treinamento diferentes - velocidade-potência e treinamento de resistência - nas mudanças na concentração plasmática de aminoácidos livres (PFAA) em repouso, durante o exercício gradual até a exaustão e o período de recuperação. Nossas coortes modelo eram atletas altamente treinados. Nossa suposição foi que o treinamento estruturado de velocidade-potência e resistência causa adaptações, resultando em diferentes concentrações de PFAA. Assumimos que as mudanças dependem da especialização esportiva de longo prazo (tipo de exercício predominante) e da fase de treinamento do ciclo de um ano (contribuição do exercício de alta intensidade baseado no metabolismo anaeróbico caracterizado pela rápida degradação da adenosina-5'-trifosfato). Uma maior contribuição do exercício de alta intensidade é utilizada por atletas de velocidade e em fases de preparação/competição específica. Há uma falta de pesquisa sobre os efeitos a longo prazo do treinamento físico nas mudanças nos PFAAs. Nós complementamos esta imagem monitorando as mudanças em um conjunto de 42 PFAAs proteinogênicos e não proteinogênicos. Os efeitos de curta e longa duração do treinamento nos níveis e no tempo de concentração de PFAA durante o exercício e a recuperação serão mostrados. Os principais objetivos eram:

1. Comparar o efeito de duas modalidades de treinamento totalmente diferentes (velocidade-potência e resistência) na concentração de PFAA.
2. Observar o efeito do caráter da carga de treinamento nas mudanças na concentração de PFAA em repouso, exercício e pós-exercício em fases consecutivas de treinamento de um ciclo de treinamento de um ano.
3. Determinar a relação entre a concentração de PFAA e a modalidade de exercício, levando em consideração a massa muscular esquelética.

II. Fundo

Apenas 3-6% da energia total utilizada durante o exercício prolongado de resistência é derivada da oxidação de AAs (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). No entanto, a proporção de energia do catabolismo de AA aumenta consideravelmente durante o exercício (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Embora o turnover de proteínas não contribua substancialmente para o gasto de energia, ele pode preencher outras funções importantes durante o exercício (Newsholm & Leech 2010). Os AAs podem retardar a depleção de glicogênio muscular (Lemon & Mullin 1980) e apoiar a gliconeogênese hepática (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

O pool de AA livre representa apenas 2% da quantidade total de AA e é armazenado no plasma e nos espaços intra e extracelular. Este pequeno pool é responsável por uma troca contínua de AAs (Wagenmakers 1998). O plasma sanguíneo serve como um reservatório temporário de AAs, cujo tamanho muda em resposta ao exercício. Diferenças no treinamento regular, exercício e atividades diárias resultam em diferenças nos níveis de PFAA (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

A duração do exercício afeta os níveis de PFAA, no entanto, a direção das mudanças pode ser diferente para AAs específicos e tipo de exercício, intensidade e duração (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik et al. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier et al. 2001, Decombaz 1979, Graham et al. 1995, Haralambie e Berg 1976, Hassmén et al. 1994, Henriksson 1991, Huq et al. 1993, Ishikura et al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). Em contraste, a concentração de AA muscular permanece relativamente estável (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

O metabolismo de AA durante o exercício prolongado foi descrito (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Uma pesquisa baseada em um curto período de treinamento (5 semanas) em atletas do tipo power sugere que as sessões de treinamento de sprint e resistência têm um efeito distinto nos AAs séricos (Pitkänen 2002b). No entanto, faltam estudos sobre as diferenças nas mudanças de adaptação a longo prazo nos PFAA entre indivíduos treinados em resistência e sprint, levando em consideração múltiplas coletas de sangue (repouso, exercício, recuperação) e massa muscular.

III. Métodos

Mais de 70 atletas com idades entre 18 e 32 anos - velocidade-potência (velocistas), resistência (triatletas, corredores de longa distância) e treinados recreacionalmente - foram recrutados. Eventualmente, os dados de 58 deles foram considerados para análise. Os atletas foram examinados quatro vezes durante o ciclo de treinamento de um ano: (1) fase de preparação geral, (2) fase de preparação específica, (3) fase de competição e (4) fase de transição.

A principal ferramenta estatística foi ANOVA de uma via e duas vias com medidas repetidas. O tamanho da amostra necessário foi calculado com base no nível alfa (significância) dado, poder estatístico e tamanho do efeito. Assumimos nível de significância α < 0,05 e poder estatístico 0,8. Com base em nossos estudos anteriores que compararam atletas treinados em sprint e resistência em termos de outros fenômenos metabólicos relacionados ao treinamento e ao exercício (Zieliński, Kusy 2012), foi adotado um eta quadrado parcial mínimo (η2) de 0,2, ou seja, um grande tamanho de efeito para diferenças entre grupos examinados e exames consecutivos eram esperadas. Outras suposições foram correção de não esfericidade = 0,75, número de medidas = 4 e correlação entre medidas repetidas = 0,5. Obteve-se o tamanho amostral mínimo total de 22 atletas.

A composição corporal foi avaliada por meio da absorciometria de raios X duplos (Lunar Prodigy, GE Healthcare, EUA). A massa muscular esquelética foi estimada usando equações de regressão (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Testes de exercício graduados em esteira (h/p/cosmos, Alemanha) foram conduzidos antes das 12h, duas horas após uma refeição padrão. A velocidade inicial era de 8 km/h e aumentada a cada 3 min em 2 km/h até a exaustão. Parâmetros respiratórios e frequência cardíaca foram medidos (ergoespirômetro MetaLyzer 3B, Cortex, Alemanha; Polar Elektro RS 400, Finlândia). O consumo máximo de oxigênio foi medido.

Amostra de sangue. O cateter venoso periférico foi colocado na veia metacarpiana dorsal. Amostras de sangue foram coletadas em repouso, durante o exercício (a cada 3 minutos, a cada mudança de velocidade) e imediatamente, 5, 10, 15, 20 e 30 minutos após o término do exercício. O volume de sangue venoso obtido durante um exame foi de 25 ml, ou seja, 2,5 ml para cada amostra, até 10 amostras. Cada amostra foi coletada em um tubo de separação de plasma contendo EDTA para posterior análise de plasma. As amostras foram centrifugadas a 13.000 revoluções/min por 3 min a 4°C. O plasma obtido foi então pipetado em frascos de 0,5 ml e imediatamente congelado em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas em -80°C até análise.

Quarenta e dois PFAAs foram testados: O-Fosfo-L-serina, O-Fosfoetanolamina, Taurina, L-Asparagina, L-Serina, Hidroxi-L-prolina, Glicina, L-Glutamina, Etanolamina, Ácido L-Aspártico, L-Citrulina , Sarcosina, β-Alanina, L-Alanina, L-Treonina, Ácido L-Glutâmico, L-Histidina, 1-Metil-L-histidina, 3-Metil-L-histidina, L-Homocitrulina, Ácido Argininosuccínico, γ-Amino -ácido n-butírico, D, ácido L-β-aminoisobutírico, ácido L-α-amino-n-butírico, ácido L- α- aminoadípico, L-anserina, L-carnosina, L-prolina, L-arginina, δ -Hidroxilisina, L-Ornitina, Cistationina, L-Cistina, L-Lisina, L-Valina, L-Metionina, L-Tirosina, L-Homocistina, L-Isoleucina, L-Leucina, L-Fenilanina, L-Triptofano. A análise dos PFAAs foi baseada na técnica LC-ESI-MS/MS e no reagente aTRAQ (Sciex), caracterizada por alta sensibilidade e especificidade, curto tempo de execução analítica, baixo volume de amostra necessário para realizar a análise e alta quantidade de analitos sendo quantificado em uma corrida.

Protocolo para determinação de PFAAs. Amostras de plasma de 40 µl foram transferidas para tubos Eppendorf. Para precipitar as proteínas presentes no plasma, adicionou-se 10 µl de ácido sulfosalicílico a 10% e o conteúdo foi misturado e centrifugado (10.000 g por 2 minutos). Em seguida, o sobrenadante foi transferido para um novo tubo e misturado com 40 µl de tampão borato. Uma alíquota de 10 µl da solução obtida foi posteriormente marcada com a solução do reagente aTRAQ Δ8 (5 µl), misturada, centrifugada e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos. A reação de marcação foi então interrompida pela adição de 5 µl de 1,2% de hidroxilamina, misturada e incubada à temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, foram adicionados 32 µl da solução do padrão interno e o conteúdo foi misturado. Na próxima etapa, a amostra foi evaporada em um concentrador a vácuo por 15 minutos para reduzir o volume da amostra para cerca de 20 µl. O resíduo foi então diluído com 20 µl de água, misturado e transferido para um frasco de amostrador automático com um inserto. Este procedimento foi modificado para medir as concentrações de PFAA que não puderam ser detectadas pelo método original. Para tanto, amostras de plasma de maior volume foram utilizadas para o procedimento de preparo da amostra. Em vez de 40 μl, amostras de plasma de 80 μl foram transferidas para tubos Eppendorf e misturadas com 20 μl de ácido sulfosalicílico a 10%. Em seguida, 20 μl do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo e misturados com 30 μl de tampão borato. As etapas subsequentes do procedimento permaneceram inalteradas. A solução padrão interna continha os mesmos AAs marcados com o reagente aTRAQ Δ0. Assim, cada PFAA determinado tinha seu padrão interno correspondente. Norleucina e norvalina, dois AAs não proteinogênicos, foram usados ​​para avaliar a eficiência de marcação e recuperação. Seus padrões internos correspondentes também estavam presentes na solução de padrão interno.

As análises foram realizadas utilizando o instrumento de cromatografia líquida 1260 Infinity (Agilent Technologies) acoplado ao espectrômetro de massas 4000 QTRAP (quadrupole ion trap) (Sciex). Este espectrômetro de massa está equipado com uma fonte de ionização por electrospray e três quadrupolos e permite realizar a análise quantitativa de PFAA prevista no projeto apresentado. A separação cromatográfica foi realizada com a coluna de cromatografia Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm). A vazão das fases móveis foi mantida em 800 μl/min. O método utiliza as seguintes fases móveis: água (fase A) e metanol (fase B), ambos com adição de 0,1 % de ácido fórmico e 0,01 % de ácido heptafluorobutírico. O tempo de análise foi de 18 minutos e durante esse tempo a separação cromatográfica foi realizada com o seguinte gradiente de eluição: de 0 a 6 min - de 2% a 40% da fase B, depois mantida a 40% da fase B por 4 minutos , aumentou para 90% da fase B até 11 min e manteve essa proporção por 1 minuto, depois diminuiu para 2% da fase B e finalmente manteve a 2% da fase B de 13 a 18 min. O volume de injeção foi fixado em 2 μl e a temperatura de separação em 50 °C. As configurações da fonte de íons foram as seguintes: gás de cortina 20 psig; tensão de pulverização iônica 4500 V; temperatura da fonte de íons 600 °C; gás de fonte de íons 1 = 60 psig, gás de fonte de íons 2 = 50 psig. O espectrômetro de massas operou no modo de ionização positiva e foram aplicados os seguintes parâmetros: potencial de entrada = 10 V; potencial de desagregação = 30 V; potencial de saída da célula de colisão = 5 V; energia de colisão = 30 eV (50 eV no caso de 7 compostos); gás de colisão: nitrogênio. Os PFAAs foram medidos no modo de monitoramento de múltiplas reações programadas (sMRM). Este modo garante alta especificidade e sensibilidade em análises quantitativas. Um teste de adequação do sistema (análise de uma mistura padrão de AAs) foi realizado antes de cada lote de amostras para aquecer e verificar o desempenho interdias de todo o sistema. A aquisição e o processamento dos dados foram realizados no software Analyst 1.5 (Sciex). O método LC-ESI-MS/MS descrito para determinação de AAs está bem estabelecido no Departamento de Química Inorgânica e Analítica, Universidade de Ciências Médicas de Poznan, o coinvestigador do projeto (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska et al. 2016, Matysiak et al. 2014).

O hemograma total foi realizado com o aparelho Mythic 18 (Orphée, Suíça). Amostras de sangue capilar da ponta do dedo (20 μl por amostra) foram coletadas simultaneamente com sangue venoso pré, durante e pós-exercício. A concentração de lactato no sangue foi medida usando o analisador C-line (EKF-Diagnostic, Germany).