Wirkung einer langanhaltenden Anpassung an Ausdauer- und Schnellkrafttraining auf die Konzentration freier Aminosäuren im Plasma (AAdaptation)

I. Studienziel

Wir verglichen die Langzeitwirkung zweier unterschiedlicher Trainingsmodalitäten – Geschwindigkeits-Kraft- und Ausdauertraining – auf Veränderungen der Konzentration freier Aminosäuren (PFAA) im Plasma im Ruhezustand, während abgestufter Belastung bis zur Erschöpfung und Erholungsphase. Unsere Modellkohorten waren hochtrainierte Athleten. Unsere Vermutung war, dass strukturiertes, lang andauerndes Schnellkraft- und Ausdauertraining Anpassungen hervorrufen, die zu unterschiedlichen PFAA-Konzentrationen führen. Wir nahmen an, dass die Veränderungen von der langfristigen Sportspezialisierung (vorherrschender Übungstyp) und der Trainingsphase des Einjahreszyklus (Beitrag von hochintensiver Übung auf der Grundlage eines anaeroben Stoffwechsels, der durch einen schnellen Adenosin-5'-Triphosphat-Abbau gekennzeichnet ist) abhängen. Ein größerer Anteil hochintensiver Übungen wird von Schnellkraftsportlern und in Phasen spezifischer Vorbereitung/Wettkämpfe eingesetzt. Es fehlt an Forschung zu den langfristigen Auswirkungen von körperlichem Training auf Veränderungen der PFAAs. Wir ergänzen dieses Bild, indem wir Veränderungen in einer Reihe von 42 proteinogenen und nicht-proteinogenen PFAAs überwachen. Es werden kurz- und lang anhaltende Auswirkungen des Trainings auf das Niveau und den Zeitverlauf der PFAA-Konzentration während des Trainings und der Erholung gezeigt. Die Hauptziele waren:

1. Um die Wirkung der beiden völlig unterschiedlichen Trainingsmodalitäten (Schnellkraft und Ausdauer) auf die PFAA-Konzentration zu vergleichen.
2. Es sollte die Wirkung des Charakters der Trainingsbelastung auf Änderungen der PFAA-Konzentration in Ruhe, während des Trainings und nach dem Training in aufeinanderfolgenden Trainingsphasen eines einjährigen Trainingszyklus beobachtet werden.
3. Bestimmung des Zusammenhangs zwischen PFAA-Konzentration und Trainingsmodalität unter Berücksichtigung der Skelettmuskelmasse.

II. Hintergrund

Nur 3-6 % der Gesamtenergie, die bei längerem Ausdauertraining verwendet wird, stammt aus der Oxidation von AAs (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Allerdings steigt der Anteil der Energie aus dem AA-Katabolismus während des Trainings erheblich an (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Obwohl der Proteinumsatz nicht wesentlich zum Energieverbrauch beiträgt, kann er während des Trainings andere wichtige Funktionen erfüllen (Newsholm & Leech 2010). AAs können den Muskelglykogenabbau verzögern (Lemon & Mullin 1980) und die hepatische Gluconeogenese unterstützen (Ahlborg et al. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Der freie AA-Pool macht nur 2 % der gesamten AA-Menge aus und wird im Plasma sowie im intra- und extrazellulären Raum gespeichert. Dieser kleine Pool sorgt für einen kontinuierlichen Austausch von AAs (Wagenmakers 1998). Blutplasma dient als temporäres Reservoir für AAs, deren Größe sich als Reaktion auf körperliche Betätigung ändert. Unterschiede in regelmäßigem Training, Bewegung und täglichen Aktivitäten führen zu Unterschieden im PFAA-Spiegel (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

Die Trainingsdauer beeinflusst die PFAA-Spiegel, die Richtung der Änderungen kann jedoch für bestimmte AAs und Trainingstyp, -intensität und -dauer unterschiedlich sein (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik ua 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier ua 2001, Decombaz 1979, Graham ua 1995, Haralambie und Berg 1976, Hassmén ua 1994, Henriksson 1991, Huq ua 1993, Ishikura ua al. 2008, Pitkänen et al. 2002a, Rennie et al. 1981, Ward et al. 1999). Im Gegensatz dazu bleibt die Muskel-AAs-Konzentration relativ stabil (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Der AA-Stoffwechsel während längerer körperlicher Betätigung wurde beschrieben (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Eine Studie, die auf einer kurzen Trainingsperiode (5 Wochen) bei Kraftsportlern basiert, legt nahe, dass Sprint- und Ausdauertrainingseinheiten einen deutlichen Effekt auf Serum-AAs haben (Pitkänen 2002b). Es fehlen jedoch Studien zu den Unterschieden der langfristigen Anpassungsveränderungen der PFAAs zwischen Ausdauer- und Sprinttrainierten unter Berücksichtigung mehrfacher Blutentnahmen (Ruhe, Belastung, Erholung) und Muskelmasse.

III. Methoden

Über 70 Athleten im Alter von 18 bis 32 Jahren – Schnellkraft (Sprinter), Ausdauersportler (Triathleten, Langstreckenläufer) und Freizeitsportler – wurden rekrutiert. Schließlich wurden die Daten von 58 von ihnen für die Analyse berücksichtigt. Die Athleten wurden während eines einjährigen Trainingszyklus viermal untersucht: (1) allgemeine Vorbereitungsphase, (2) spezifische Vorbereitungsphase, (3) Wettkampfphase und (4) Übergangsphase.

Das wichtigste statistische Werkzeug war die Einweg- und Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen. Die erforderliche Stichprobengröße wurde auf der Grundlage des angegebenen Alpha-(Signifikanz-)Niveaus, der statistischen Aussagekraft und der Effektgröße berechnet. Wir haben das Signifikanzniveau α < 0,05 und die statistische Power 0,8 angenommen. Basierend auf unseren früheren Studien, in denen sprint- und ausdauertrainierte Athleten in Bezug auf andere Stoffwechselphänomene im Zusammenhang mit Training und Bewegung verglichen wurden (Zieliński, Kusy 2012), wurde ein minimales partielles Eta-Quadrat (η2) von 0,2 angenommen, d. h. eine große Effektgröße für Unterschiede zwischen den untersuchten Gruppen und konsekutive Untersuchung über wurden erwartet. Weitere Annahmen waren Unrundheitskorrektur = 0,75, Anzahl der Messungen = 4 und Korrelation zwischen wiederholten Messungen = 0,5. Die minimale Gesamtstichprobengröße von 22 Athleten wurde erreicht.

Die Körperzusammensetzung wurde mittels Dual-Röntgen-Absorptiometrie (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA) beurteilt. Die Skelettmuskelmasse wurde mithilfe von Regressionsgleichungen geschätzt (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Bewertete Belastungstests auf einem Laufband (h/p/cosmos, Deutschland) wurden vor 00:00 Uhr, zwei Stunden nach einer Standardmahlzeit, durchgeführt. Die Anfangsgeschwindigkeit betrug 8 km/h und wurde bis zur Erschöpfung alle 3 min um 2 km/h gesteigert. Atmungsparameter und Herzfrequenz wurden gemessen (Ergospirometer MetaLyzer 3B, Cortex, Deutschland; Polar Elektro RS 400, Finnland). Der maximale Sauerstoffverbrauch wurde gemessen.

Blutprobe. Ein peripherer Venenkatheter wurde in die dorsale Mittelhandvene gelegt. Blutproben wurden in Ruhe, während des Trainings (alle 3 Minuten, bei jeder Geschwindigkeitsänderung) und sofort, 5, 10, 15, 20 und 30 Minuten nach Abschluss des Trainings, entnommen. Das während einer Untersuchung entnommene Volumen an venösem Blut betrug 25 ml, d. h. 2,5 ml für jede Probe, bis zu 10 Proben. Jede Probe wurde zur weiteren Plasmaanalyse in ein EDTA enthaltendes Plasmatrennröhrchen gesammelt. Die Proben wurden bei 13.000 Umdrehungen/min für 3 min bei 4°C zentrifugiert. Das erhaltene Plasma wurde dann in 0,5-ml-Röhrchen pipettiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. Die Proben wurden bis zur Analyse bei –80°C gelagert.

Es wurden 42 PFAAs getestet: O-Phospho-L-Serin, O-Phosphoethanolamin, Taurin, L-Asparagin, L-Serin, Hydroxy-L-Prolin, Glycin, L-Glutamin, Ethanolamin, L-Asparaginsäure, L-Citrullin , Sarcosin, β-Alanin, L-Alanin, L-Threonin, L-Glutaminsäure, L-Histidin, 1-Methyl-L-Histidin, 3-Methyl-L-Histidin, L-Homocitrullin, Argininobernsteinsäure, γ-Amino -n-Buttersäure, D, L-β-Aminoisobuttersäure, L-α-Amino-n-buttersäure, L-α-Aminoadipinsäure, L-Anserin, L-Carnosin, L-Prolin, L-Arginin, δ -Hydroxylysin, L-Ornithin, Cystathionin, L-Cystin, L-Lysin, L-Valin, L-Methionin, L-Tyrosin, L-Homocystin, L-Isoleucin, L-Leucin, L-Phenylanin, L-Tryptophan. Die Analyse von PFAAs basierte auf der LC-ESI-MS/MS-Technik und dem aTRAQ (Sciex)-Reagenz, das sich durch hohe Empfindlichkeit und Spezifität, kurze analytische Laufzeit, geringes Probenvolumen, das zur Durchführung der Analyse erforderlich ist, und hohe Menge an Analyten auszeichnet in einem Lauf quantifiziert werden.

Protokoll zur Bestimmung von PFAAs. Plasmaproben von 40 &mgr;l wurden in Eppendorf-Röhrchen überführt. Um im Plasma vorhandene Proteine ​​auszufällen, wurden 10 &mgr;l 10%ige Sulfosalicylsäure zugegeben und der Inhalt gemischt und zentrifugiert (10.000 g für 2 Minuten). Danach wurde der Überstand in ein neues Röhrchen überführt und mit 40 &mgr;l Boratpuffer gemischt. Ein Aliquot von 10 &mgr;l der erhaltenen Lösung wurde anschließend mit der aTRAQ-Reagenz-&Dgr;8-Lösung (5 &mgr;l) markiert, gemischt, zentrifugiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert. Die Markierungsreaktion wurde dann durch Zugabe von 5 &mgr;l 1,2 % Hydroxylamin gestoppt, gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden 32 µl der internen Standardlösung zugegeben und der Inhalt gemischt. Im nächsten Schritt wurde die Probe in einem Vakuumkonzentrator für 15 Minuten eingedampft, um das Volumen der Probe auf etwa 20 &mgr;l zu reduzieren. Der Rückstand wurde dann mit 20 &mgr;l Wasser verdünnt, gemischt und in ein Autosampler-Fläschchen mit Einsatz überführt. Dieses Verfahren wurde modifiziert, um die Konzentrationen von PFAAs zu messen, die mit der ursprünglichen Methode nicht nachgewiesen werden konnten. Zu diesem Zweck wurden für die Probenvorbereitung Plasmaproben mit höherem Volumen verwendet. Statt 40 µl wurden Plasmaproben von 80 µl in Eppendorf-Röhrchen überführt und mit 20 µl 10 %iger Sulfosalicylsäure versetzt. Danach wurden 20 µl des Überstands in ein neues Röhrchen überführt und mit 30 µl Boratpuffer gemischt. Die weiteren Verfahrensschritte blieben unverändert. Die interne Standardlösung enthielt dieselben mit dem aTRAQ-Reagenz Δ0 markierten AS. Somit hatte jedes bestimmte PFAA seinen entsprechenden internen Standard. Norleucin und Norvalin, zwei nicht-proteinogene AAs, wurden verwendet, um die Markierungseffizienz und Wiederfindung zu bewerten. Ihre entsprechenden internen Standards waren auch in der internen Standardlösung vorhanden.

Die Analysen wurden unter Verwendung des Flüssigkeitschromatographie-Instruments 1260 Infinity (Agilent Technologies) durchgeführt, das mit dem Massenspektrometer 4000 QTRAP (Quadrupol-Ionenfalle) (Sciex) gekoppelt war. Dieses Massenspektrometer ist mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle und drei Quadrupolen ausgestattet und ermöglicht die im Rahmen des vorgestellten Projekts geplante quantitative PFAA-Analyse durchzuführen. Die chromatographische Trennung wurde mit der Chromatographiesäule Sciex C18 (5 µm, 4,6 mm x 150 mm) durchgeführt. Die Flussrate der mobilen Phasen wurde bei 800 &mgr;l/min gehalten. Das Verfahren verwendet die folgenden mobilen Phasen: Wasser (Phase A) und Methanol (Phase B), beide mit Zusatz von 0,1 % Ameisensäure und 0,01 % Heptafluorbuttersäure. Die Analysezeit betrug 18 Minuten und während dieser Zeit wurde die chromatographische Trennung mit der folgenden Gradientenelution durchgeführt: von 0 bis 6 min - von 2 % bis 40 % Phase B, dann 4 Minuten bei 40 % Phase B gehalten , bis 11 min auf 90 % der Phase B erhöht und 1 Minute lang bei diesem Verhältnis gehalten, dann auf 2 % der Phase B verringert und schließlich von 13 bis 18 min auf 2 % der Phase B gehalten. Das Injektionsvolumen wurde auf 2 μl und die Trenntemperatur auf 50 °C eingestellt. Die Ionenquelleneinstellungen waren die folgenden: Vorhanggas 20 psig; Ionensprühspannung 4500 V; Ionenquellentemperatur 600 °C; Ionenquellengas 1 = 60 psig, Ionenquellengas 2 = 50 psig. Das Massenspektrometer wurde im positiven Ionisationsmodus betrieben und die folgenden Parameter wurden angelegt: Eingangspotential = 10 V; Declustering-Potenzial = 30 V; Stoßzellenausgangspotential = 5 V; Stoßenergie = 30 eV (50 eV im Fall von 7 Verbindungen); Kollisionsgas: Stickstoff. Die PFAAs wurden im planmäßigen Multiple-Reaction-Monitoring-Modus (sMRM) gemessen. Dieser Modus gewährleistet eine hohe Spezifität und Sensitivität bei quantitativen Analysen. Vor jeder Probencharge wurde ein Systemeignungstest (Analyse einer Standardmischung von AAs) durchgeführt, um das Gesamtsystem aufzuwärmen und die Tagesleistung zu überprüfen. Die Datenerfassung und -verarbeitung erfolgte mit der Software Analyst 1.5 (Sciex). Die beschriebene LC-ESI-MS/MS-Methode zur Bestimmung von AAs ist im Department of Anorganic and Analytical Chemistry, Poznan University of Medical Sciences, dem Ko-Untersucher des Projekts, gut etabliert (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska ua 2016, Matysiak ua 2014).

Das Gesamtblutbild wurde mit dem Gerät Mythic 18 (Orphée, Schweiz) durchgeführt. Kapillarblutproben aus der Fingerbeere (20 μl pro Probe) wurden gleichzeitig mit venösem Blut vor, während und nach dem Training entnommen. Die Blutlaktatkonzentration wurde mit einem C-line Analysegerät (EKF-Diagnostic, Deutschland) gemessen.