Vliv dlouhodobé adaptace na vytrvalostní a rychlostně-silový trénink na koncentraci volných aminokyselin v plazmě (AAdaptation)

I. Cíl studie

Porovnávali jsme dlouhodobý účinek dvou různých tréninkových modalit – rychlostně-silového a vytrvalostního tréninku – na změny koncentrace volných aminokyselin v plazmě (PFAA) v klidu, během stupňované zátěže až do vyčerpání a období regenerace. Naše modelové kohorty byli vysoce trénovaní sportovci. Naším předpokladem bylo, že strukturovaný dlouhotrvající rychlostně-silový a vytrvalostní trénink způsobí adaptace vedoucí k rozdílné koncentraci PFAA. Předpokládali jsme, že změny závisí na dlouhodobé sportovní specializaci (převažující typ cvičení) a tréninkové fázi ročního cyklu (příspěvek vysoce intenzivního cvičení založeného na anaerobním metabolismu charakterizovaném rychlou degradací adenosin-5'-trifosfátu). Větší příspěvek vysokointenzivního cvičení využívají rychlostně siloví sportovci a ve fázích specifické přípravy/soutěže. Existuje nedostatek výzkumu o dlouhodobých účincích fyzického tréninku na změny v PFAA. Tento obraz doplňujeme sledováním změn v souboru 42 proteinogenních a neproteinogenních PFAA. Budou ukázány krátkodobé a dlouhodobé účinky tréninku na úrovně a časový průběh koncentrace PFAA během cvičení a regenerace. Hlavní cíle byly:

1. Porovnat účinek dvou zcela odlišných tréninkových modalit (rychlost-síla a vytrvalost) na koncentraci PFAA.
2. Sledovat vliv charakteru tréninkové zátěže na změny v klidové, zátěžové a pozátěžové koncentraci PFAA v po sobě jdoucích tréninkových fázích ročního tréninkového cyklu.
3. Určit souvislost mezi koncentrací PFAA a modalitou cvičení s přihlédnutím k hmotě kosterního svalstva.

II. Pozadí

Pouze 3-6 % celkové energie využité během dlouhodobého vytrvalostního cvičení pochází z oxidace AA (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). Podíl energie z katabolismu AA se však během cvičení značně zvyšuje (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). I když se proteinový obrat významně nepodílí na energetickém výdeji, může během cvičení plnit další důležité funkce (Newsholm & Leech 2010). AA mohou zpomalit vyčerpání svalového glykogenu (Lemon & Mullin 1980) a podporovat jaterní glukoneogenezi (Ahlborg a kol. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Volný pool AA tvoří pouze 2 % celkového množství AA a je uložen v plazmě a intra- a extracelulárních prostorech. Tento malý fond odpovídá za nepřetržitou výměnu AA (Wagenmakers 1998). Krevní plazma slouží jako dočasný rezervoár AA, jejichž velikost se mění v reakci na zátěž. Rozdíly v pravidelném tréninku, cvičení a denních aktivitách mají za následek rozdíly v úrovních PFAA (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

Délka cvičení ovlivňuje hladiny PFAA, nicméně směr změn může být odlišný pro konkrétní AA a typ cvičení, intenzitu a trvání (Ahlborg et al. 1974, Areces et al. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik a kol. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier a kol. 2001, Decombaz 1979, Graham a kol. 1995, Haralambie a Berg 1976, Hassmén a kol. 2008, Pitkänen a kol., 2002a, Rennie a kol., 1981, Ward a kol., 1999). Naproti tomu svalová koncentrace AA zůstává relativně stabilní (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

Metabolismus AA během dlouhodobého cvičení byl popsán (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Jeden výzkum založený na krátkém tréninkovém období (5 týdnů) u sportovců silového typu naznačuje, že sprintové a vytrvalostní tréninky mají výrazný vliv na sérové ​​AA (Pitkänen 2002b). Chybí však studie o rozdílech v dlouhodobých adaptačních změnách u PFAA mezi jedinci trénovanými na vytrvalost a sprint, s přihlédnutím k vícenásobným odběrům krve (odpočinek, cvičení, regenerace) a svalové hmoty.

III. Metody

Bylo přijato více než 70 sportovců ve věku 18-32 let – rychlostně-silové (sprinteři), vytrvalostní (triatlonisté, dálkoví běžci) a rekreačně trénovaní. Nakonec byla pro analýzu zvážena data 58 z nich. Sportovci byli vyšetřeni čtyřikrát během jednoletého tréninkového cyklu: (1) obecná přípravná fáze, (2) specifická přípravná fáze, (3) soutěžní fáze a (4) přechodná fáze.

Hlavním statistickým nástrojem byla jednosměrná a obousměrná ANOVA s opakovanými měřeními. Požadovaná velikost vzorku byla vypočtena na základě dané hladiny alfa (významnosti), statistické síly a velikosti účinku. Předpokládali jsme hladinu významnosti α < 0,05 a statistickou sílu 0,8. Na základě našich dřívějších studií, které porovnávaly sportovce trénované ve sprintu a vytrvalosti z hlediska dalších metabolických jevů souvisejících s tréninkem a cvičením (Zieliński, Kusy 2012), byla přijata minimální parciální eta kvadrát (η2) 0,2, tj. velká velikost účinku pro očekávaly se rozdíly mezi zkoumanými skupinami a následné vyšetření napříč. Další předpoklady byly korekce nesféričnosti = 0,75, počet měření = 4 a korelace mezi opakovanými měřeními = 0,5. Byla získána minimální celková velikost vzorku 22 sportovců.

Tělesné složení bylo hodnoceno pomocí duální rentgenové absorpciometrie (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). Hmota kosterního svalstva byla odhadnuta pomocí regresních rovnic (Kim et al. 2002, Kim et al. 2006).

Stupňované zátěžové testy na běžeckém pásu (h/p/cosmos, Německo) byly provedeny před 12:00, dvě hodiny po standardním jídle. Počáteční rychlost byla 8 km/h a zvyšovala se každé 3 minuty o 2 km/h až do vyčerpání. Byly měřeny parametry dýchání a srdeční frekvence (ergospirometr MetaLyzer 3B, Cortex, Německo; Polar Elektro RS 400, Finsko). Byla naměřena maximální spotřeba kyslíku.

Odběr krve. Periferní žilní katétr byl zaveden do dorzální metakarpální žíly. Vzorky krve byly odebírány v klidu, během cvičení (každé 3 minuty, při každé změně rychlosti) a okamžitě, 5, 10, 15, 20 a 30 minut po dokončení cvičení. Objem žilní krve získaný při jednom vyšetření byl 25 ml, tj. 2,5 ml na každý vzorek, do 10 vzorků. Každý vzorek byl odebrán do zkumavky pro separaci plazmy obsahující EDTA pro další analýzu plazmy. Vzorky byly centrifugovány při 13 000 otáčkách/min po dobu 3 minut při 4 °C. Získaná plazma byla poté napipetována do 0,5 ml lahviček a okamžitě zmražena v kapalném dusíku. Vzorky byly až do analýzy skladovány při -80 °C.

Bylo testováno 42 PFAA: O-fosfo-L-serin, O-fosfoethanolamin, taurin, L-asparagin, L-serin, hydroxy-L-prolin, glycin, L-glutamin, ethanolamin, kyselina L-asparagová, L-citrulin , sarkosin, β-alanin, L-alanin, L-threonin, kyselina L-glutamová, L-histidin, 1-methyl-L-histidin, 3-methyl-L-histidin, L-homocitrulin, kyselina argininojantarová, γ-amino kyselina -n-máselná, D, kyselina L-β-aminoisobomáselná, kyselina L-α-amino-n-máselná, kyselina L-α-aminoadipová, L-Anserin, L-karnosin, L-prolin, L-arginin, δ -Hydroxylysin, L-ornitin, cystathionin, L-cystin, L-lysin, L-valin, L-methionin, L-tyrosin, L-homocystin, L-isoleucin, L-leucin, L-fenyllanin, L-tryptofan. Analýza PFAA byla založena na technice LC-ESI-MS/MS a reagencii aTRAQ (Sciex), která se vyznačuje vysokou citlivostí a specificitou, krátkou dobou analýzy, malým objemem vzorku potřebným k provedení analýzy a vysokým množstvím analytů. kvantifikovány v jednom běhu.

Protokol pro stanovení PFAA. Vzorky plazmy o objemu 40 ul byly přeneseny do zkumavek Eppendorf. Za účelem vysrážení proteinů přítomných v plazmě bylo přidáno 10 ul 10% kyseliny sulfosalicylové a obsah byl promíchán a odstředěn (10 000 g po dobu 2 minut). Poté byl supernatant přenesen do nové zkumavky a smíchán se 40 ul borátového pufru. Alikvot 10 ul získaného roztoku byl následně označen roztokem činidla aTRAQ A8 (5 ul), promíchán, centrifugován a inkubován při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Značkovací reakce byla poté zastavena přidáním 5 ul 1,2% hydroxylaminu, promíchána a inkubována při teplotě místnosti po dobu 15 minut. Poté bylo přidáno 32 ul roztoku vnitřního standardu a obsah byl promíchán. V dalším kroku byl vzorek odpařován ve vakuovém koncentrátoru po dobu 15 minut pro snížení objemu vzorku na přibližně 20 ul. Zbytek byl poté zředěn 20 ul vody, promíchán a přenesen do lahvičky autosampleru s vložkou. Tento postup byl upraven za účelem měření koncentrací PFAA, které nebylo možné detekovat původní metodou. K tomuto účelu byly pro přípravu vzorku použity vzorky plazmy o větším objemu. Místo 40 μl byly vzorky plazmy o objemu 80 μl přeneseny do Eppendorfových zkumavek a smíchány s 20 μl 10% kyseliny sulfosalicylové. Poté bylo 20 μl supernatantu přeneseno do nové zkumavky a smícháno s 30 μl borátového pufru. Následující kroky postupu zůstaly nezměněny. Roztok vnitřního standardu obsahoval stejné AA označené reagencií aTRAQ Δ0. Každý stanovený PFAA měl tedy svůj odpovídající vnitřní standard. Norleucin a norvalin, dvě neproteinogenní AA, byly použity k hodnocení účinnosti značení a výtěžnosti. Jejich odpovídající vnitřní standardy byly také přítomny v roztoku vnitřního standardu.

Analýzy byly provedeny pomocí přístroje pro kapalinovou chromatografii 1260 Infinity (Agilent Technologies) spojeného s hmotnostním spektrometrem 4000 QTRAP (kvadrupólová iontová past) (Sciex). Tento hmotnostní spektrometr je vybaven elektrosprejovým ionizačním zdrojem a třemi kvadrupóly a umožňuje provádět kvantitativní analýzu PFAA plánovanou v rámci předkládaného projektu. Chromatografická separace byla provedena pomocí chromatografické kolony Sciex C18 (5 um, 4,6 mm x 150 mm). Průtok mobilních fází byl udržován na 800 μl/min. Metoda využívá tyto mobilní fáze: voda (fáze A) a methanol (fáze B), obě s přídavkem 0,1 % kyseliny mravenčí a 0,01 % kyseliny heptafluormáselné. Doba analýzy byla 18 minut a během této doby probíhala chromatografická separace s následujícím gradientovým eluováním: od 0 do 6 minut - od 2 % do 40 % fáze B, poté udržována na 40 % fáze B po dobu 4 minut , zvýšena na 90 % fáze B do 11 minut a udržována v tomto poměru fází po dobu 1 minuty, poté snížena na 2 % fáze B a nakonec udržována na 2 % fáze B od 13 do 18 minut. Nástřikový objem byl nastaven na 2 μl a separační teplota na 50 °C. Nastavení iontového zdroje bylo následující: clonový plyn 20 psig; napětí iontového spreje 4500 V; teplota iontového zdroje 600 °C; iontový zdroj plynu 1 = 60 psig, iontový zdroj plynu 2 = 50 psig. Hmotnostní spektrometr pracoval v pozitivním ionizačním módu a byly použity následující parametry: vstupní potenciál = 10 V; potenciál deklastrování = 30 V; výstupní potenciál kolizního článku = 5 V; energie srážky = 30 eV (50 eV v případě 7 sloučenin); srážkový plyn: dusík. PFAA byly měřeny v režimu plánovaného monitorování více reakcí (sMRM). Tento režim zajišťuje vysokou specificitu a citlivost v kvantitativních analýzách. Před každou dávkou vzorků byl proveden test vhodnosti systému (analýza standardní směsi AA) za účelem zahřátí a kontroly mezidenního výkonu celého systému. Získávání a zpracování dat bylo prováděno pomocí softwaru Analyst 1.5 (Sciex). Popsaná metoda LC-ESI-MS/MS pro stanovení AA je dobře zavedená na katedře anorganické a analytické chemie, Poznaňská univerzita lékařských věd, spoluřešitel projektu (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska a kol., 2016, Matysiak a kol., 2014).

Celkový krevní obraz byl proveden pomocí přístroje Mythic 18 (Orphée, Švýcarsko). Vzorky kapilární krve z konečku prstu (20 μl na vzorek) byly odebrány současně s žilní krví před, během a po cvičení. Koncentrace laktátu v krvi byla měřena pomocí C-line analyzátoru (EKF-Diagnostic, Německo).