Pitkäkestoisen kestävyys- ja nopeus-voimaharjoittelun vaikutus plasmavapaiden aminohappojen pitoisuuteen (AAdaptation)

I. Opintojen tavoite

Vertailimme kahden eri harjoitusmuodon - nopeus-voima- ja kestävyysharjoittelu - pitkäaikaista vaikutusta plasman vapaiden aminohappojen (PFAA) pitoisuuden muutoksiin levossa, asteittaisen harjoituksen aikana uupumus- ja palautumisjaksoon asti. Malliryhmämme olivat korkeasti koulutettuja urheilijoita. Oletuksemme oli, että strukturoitu pitkäkestoinen nopeus-voima- ja kestävyysharjoittelu aiheuttavat mukautuksia, jotka johtavat erilaisiin PFAA-pitoisuuksiin. Oletimme, että muutokset riippuvat pitkän aikavälin urheilun erikoistumisesta (vallitseva harjoitustyyppi) ja yhden vuoden syklin harjoitteluvaiheesta (anaerobiseen aineenvaihduntaan perustuvan korkean intensiteetin harjoittelun osuus, jolle on ominaista nopea adenosiini-5'-trifosfaatin hajoaminen). Suurempaa panosta korkean intensiteetin harjoitteluun käyttävät nopeus-voima-urheilijat ja tietyn valmistelun/kilpailun vaiheissa. Fyysisen harjoittelun pitkän aikavälin vaikutuksista PFAA:iden muutoksiin ei ole tutkimusta. Täydennämme tätä kuvaa seuraamalla muutoksia 42:n proteiinigeenisen ja ei-proteinogeenisen PFAA:n sarjassa. Harjoittelun lyhyt- ja pitkäkestoiset vaikutukset PFAA-pitoisuuden tasoihin ja ajan kulumiseen harjoituksen ja palautumisen aikana näytetään. Päätavoitteet olivat:

1. Vertaamaan kahden täysin erilaisen harjoitusmenetelmän (nopeus-voima ja kestävyys) vaikutusta PFAA-pitoisuuteen.
2. Tarkkaile harjoituskuormituksen vaikutusta lepo-, harjoitus- ja harjoituksen jälkeisiin PFAA-pitoisuuden muutoksiin yhden vuoden harjoitussyklin peräkkäisissä harjoitusvaiheissa.
3. PFAA-pitoisuuden ja harjoitusmuodon välisen yhteyden määrittäminen ottaen huomioon luuston lihasmassan.

II. Tausta

Vain 3-6 % pitkäaikaisen kestävyysharjoittelun aikana käytetystä kokonaisenergiasta on peräisin AA:iden hapettumisesta (Hargreaves & Snow 2001, Tarnopolski 2004, Wolfe et al. 1984). AA-kataboliasta peräisin olevan energian osuus kuitenkin kasvaa huomattavasti harjoituksen aikana (Ballard & Tomas 1983, Rennie et al. 1981). Vaikka proteiinin vaihtuvuus ei merkittävästi vaikuta energiankulutukseen, se voi täyttää muita tärkeitä toimintoja harjoituksen aikana (Newsholm & Leech 2010). AA:t voivat viivästyttää lihasten glykogeenivajetta (Lemon & Mullin 1980) ja tukea maksan glukoneogeneesiä (Ahlborg et ai. 1974, Ahlborg & Felig 1982, Felig & Wahren 1971).

Vapaa AA-pooli on vain 2 % AA:n kokonaismäärästä, ja se varastoituu plasmaan sekä solunsisäisiin ja ekstrasellulaarisiin tiloihin. Tämä pieni pooli vastaa jatkuvasta AA:iden vaihdosta (Wagenmakers 1998). Veriplasma toimii tilapäisenä AA-varastona, jonka koko muuttuu liikunnan seurauksena. Erot säännöllisessä harjoittelussa, harjoittelussa ja päivittäisessä toiminnassa johtavat eroihin PFAA-tasoissa (Einspahr & Tharp 1989, Henriksson 1991, Xiao et al. 2016).

Harjoituksen kesto vaikuttaa PFAA-tasoihin, mutta muutosten suunta voi olla erilainen tietyn AA:n ja harjoituksen tyypin, intensiteetin ja keston mukaan (Ahlborg et al. 1974, Areces ym. 2015, Blomstrand et al. 1988, Blomstrand et al. 1997, Borgenvik ym. 2012, Castell & Newsholme 1988, Cuisinier ym. 2001, Decombaz 1979, Graham ym. 1995, Haralambie ja Berg 1976, Hassmén ym. 1994, Henriksson et ai.1, Huqkur 1994 al. 2008, Pitkänen ym. 2002a, Rennie ym. 1981, Ward ym. 1999). Sitä vastoin lihasten AA-pitoisuus pysyy suhteellisen vakaana (Graham 1995, Henriksson 1991, Rennie 1981).

AA-aineenvaihdunta pitkäaikaisen harjoituksen aikana on kuvattu (Gibala 2001, Hargreaves & Snow 2001). Eräs tutkimus, joka perustuu lyhyeen harjoitusjaksoon (5 viikkoa) voima-tyyppisillä urheilijoilla, viittaa siihen, että sprintti- ja kestävyysharjoitteluilla on selvä vaikutus seerumin AA-arvoihin (Pitkänen 2002b). Tutkimuksia ei kuitenkaan ole tutkittu eroista PFAA:n pitkäaikaisissa sopeutumismuutoksissa kestävyys- ja sprinttiharjoittelun harjoittaneiden yksilöiden välillä, kun otetaan huomioon useat verinäytteet (lepo, harjoitus, palautuminen) ja lihasmassa.

III. menetelmät

Rekrytoitiin yli 70 iältään 18-32-vuotiasta urheilijaa - nopeus-voima (sprinterit), kestävyys (triathlonistit, matkajuoksijat) ja virkistysharjoittelijat. Lopulta heistä 58 tiedot otettiin huomioon analysoitavaksi. Urheilijoita tutkittiin neljä kertaa yhden vuoden harjoitusjakson aikana: (1) yleinen valmistautumisvaihe, (2) erityinen valmisteluvaihe, (3) kilpailuvaihe ja (4) siirtymävaihe.

Pääasiallinen tilastollinen työkalu oli yksisuuntainen ja kaksisuuntainen ANOVA toistuvin mittauksin. Vaadittu otoskoko laskettiin annetun alfa-tason (merkittävyys), tilastollisen tehon ja vaikutuskoon perusteella. Oletimme merkitsevyystason α < 0,05 ja tilastollisen tehon 0,8. Perustuen aikaisempiin tutkimuksiimme, joissa verrattiin sprintti- ja kestävyysharjoituksia harjoittaneita urheilijoita muiden harjoitteluun ja harjoitteluun liittyvien aineenvaihduntailmiöiden suhteen (Zieliński, Kusy 2012), otettiin käyttöön pienin osittainen eta-neliö (η2) 0,2, eli suuri vaikutuskoko eroja tutkittujen ryhmien ja peräkkäisen tutkimuksen välillä odotettiin. Muita oletuksia olivat epäsfäärisyyskorjaus = 0,75, mittausten lukumäärä = 4 ja toistuvien mittausten välinen korrelaatio = 0,5. Kokonaisotoksen vähimmäiskoko on 22 urheilijaa.

Kehon koostumus arvioitiin käyttämällä kaksoisröntgenabsorptiometriaa (Lunar Prodigy, GE Healthcare, USA). Luuston lihasmassaa arvioitiin regressioyhtälöiden avulla (Kim et al. 2002, Kim ym. 2006).

Arvioidut rasitustestit juoksumatolla (h/p/cosmos, Saksa) suoritettiin ennen kello 12:ta, kaksi tuntia tavallisen aterian jälkeen. Alkunopeus oli 8 km/h ja nousi 3 minuutin välein 2 km/h loppuun asti. Hengitysparametrit ja syke mitattiin (ergospirometri MetaLyzer 3B, Cortex, Saksa; Polar Elektro RS 400, Suomi). Suurin hapenkulutus mitattiin.

Verinäytteenotto. Perifeerinen laskimokatetri asetettiin dorsaaliseen metakarpaaliseen laskimoon. Verinäytteet otettiin levossa, harjoituksen aikana (3 minuutin välein, jokaisen nopeuden muutoksen yhteydessä) ja välittömästi, 5, 10, 15, 20 ja 30 minuuttia harjoituksen päättymisen jälkeen. Yhdellä tutkimuksella saatu laskimoveren tilavuus oli 25 ml, eli 2,5 ml jokaista näytettä kohden, 10 näytettä asti. Jokainen näyte kerättiin plasma-erotusputkeen, joka sisälsi EDTA:ta lisäplasma-analyysiä varten. Näytteitä sentrifugoitiin 13 000 kierrosta/min 3 minuuttia 4 °C:ssa. Saatu plasma pipetoitiin sitten 0,5 ml:n pulloihin ja jäädytettiin välittömästi nestetypessä. Näytteitä säilytettiin -80 °C:ssa analyysiin asti.

42 PFAA:ta määritettiin: O-fosfo-L-seriini, O-fosfoetanoliamiini, tauriini, L-asparagiini, L-seriini, hydroksi-L-proliini, glysiini, L-glutamiini, etanoliamiini, L-asparagiinihappo, L-sitrulliini Sarkosiini, β-alaniini, L-alaniini, L-treoniini, L-glutamiinihappo, L-histidiini, 1-metyyli-L-histidiini, 3-metyyli-L-histidiini, L-homositrulliini, arginiinimeripihkahappo, γ-amino -n-voihappo, D, L-β-aminoisovoihappo, L-α-amino-n-voihappo, L-α-aminoadipiinihappo, L-anseriini, L-karnosiini, L-proliini, L-arginiini, δ -Hydroksylysiini, L-ornitiini, kystationiini, L-kystiini, L-lysiini, L-valiini, L-metioniini, L-tyrosiini, L-homokystiini, L-isoleusiini, L-leusiini, L-fenyylianiini, L-tryptofaani. PFAA:iden analyysi perustui LC-ESI-MS/MS-tekniikkaan ja aTRAQ (Sciex) -reagenssiin, joille on tunnusomaista korkea herkkyys ja spesifisyys, lyhyt analyyttinen ajoaika, pieni analyysin suorittamiseen vaadittava näytetilavuus ja suuri määrä analyyttejä. mitataan yhdellä kertaa.

Protokolla PFAA:iden määrittämiseksi. 40 ui:n plasmanäytteet siirrettiin Eppendorf-putkiin. Plasmassa olevien proteiinien saostamiseksi lisättiin 10 ui 10 % sulfosalisyylihappoa ja sisältö sekoitettiin ja sentrifugoitiin (10 000 g 2 minuuttia). Tämän jälkeen supernatantti siirrettiin uuteen putkeen ja sekoitettiin 40 ul:aan boraattipuskuria. Tämän jälkeen saadun liuoksen 10 ui:n erä leimattiin aTRAQ-reagenssi-A8-liuoksella (5 ui), sekoitettiin, sentrifugoitiin ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia. Leimausreaktio pysäytettiin sitten lisäämällä 5 ui 1,2 % hydroksyyliamiinia, sekoitettiin ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 15 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin 32 ui sisäistä standardiliuosta ja sisältö sekoitettiin. Seuraavassa vaiheessa näytettä haihdutettiin vakuumikonsentraattorissa 15 minuutin ajan näytteen tilavuuden pienentämiseksi noin 20 ul:aan. Jäännös laimennettiin sitten 20 ul:lla vettä, sekoitettiin ja siirrettiin automaattiseen näytteenottopulloon, jossa oli insertti. Tätä menetelmää muutettiin sellaisten PFAA-yhdisteiden pitoisuuksien mittaamiseksi, joita ei voitu havaita alkuperäisellä menetelmällä. Tätä tarkoitusta varten näytteenvalmistusmenettelyssä käytettiin tilavuudeltaan suurempia plasmanäytteitä. 40 µl:n sijasta 80 µl:n plasmanäytteet siirrettiin Eppendorf-putkiin ja sekoitettiin 20 µl:aan 10 % sulfosalisyylihappoa. Sen jälkeen 20 μl supernatanttia siirrettiin uuteen putkeen ja sekoitettiin 30 μl:aan boraattipuskuria. Menettelyn seuraavat vaiheet säilyivät ennallaan. Sisäinen standardiliuos sisälsi samoja AA:ita, jotka oli leimattu aTRAQ-reagenssilla A0. Siten jokaisella määritetyllä PFAA:lla oli vastaava sisäinen standardi. Norleusiinia ja norvaliinia, kahta ei-proteinogeenistä AA:ta, käytettiin leimauksen tehokkuuden ja talteenoton arvioimiseen. Niiden vastaavat sisäiset standardit olivat myös sisäisessä standardiliuoksessa.

Analyysit suoritettiin käyttämällä nestekromatografialaitetta 1260 Infinity (Agilent Technologies), joka oli kytketty 4000 QTRAP (quadrupoli ion trap) -massaspektrometriin (Sciex). Tämä massaspektrometri on varustettu sähkösumutusionisaatiolähteellä ja kolmella kvadrupolilla ja mahdollistaa esitellyssä projektissa suunnitellun kvantitatiivisen PFAA-analyysin suorittamisen. Kromatografinen erotus suoritettiin Sciex C18 (5 μm, 4,6 mm x 150 mm) kromatografiakolonnilla. Liikkuvien faasien virtausnopeus pidettiin 800 μl/min. Menetelmässä käytetään seuraavia liikkuvia faaseja: vesi (faasi A) ja metanoli (faasi B), molempiin lisäten 0,1 % muurahaishappoa ja 0,01 % heptafluorivoihappoa. Analyysiaika oli 18 minuuttia ja sen aikana suoritettiin kromatografinen erotus seuraavalla gradienttieluoinnilla: 0 - 6 min - 2 % - 40 % faasia B, sitten pidettiin 40 % faasista B 4 minuuttia. , nostettiin 90 %:iin faasista B 11 minuuttiin ja pidettiin tässä suhteessa faasit 1 minuutti, sitten laski 2 %:iin faasista B ja lopuksi pidettiin 2 %:ssa faasista B 13 - 18 minuuttia. Injektiotilavuus asetettiin 2 μl:ksi ja erotuslämpötilaksi 50 °C. Ionilähdeasetukset olivat seuraavat: verhokaasu 20 psig; ionisuihkujännite 4500 V; ionilähteen lämpötila 600 °C; ionilähdekaasu 1 = 60 psig, ionilähdekaasu 2 = 50 psig. Massaspektrometri toimi positiivisessa ionisaatiotilassa ja käytettiin seuraavia parametreja: sisääntulopotentiaali = 10 V; purkamispotentiaali = 30 V; törmäyskennon ulostulopotentiaali = 5 V; törmäysenergia = 30 eV (50 eV 7 yhdisteen tapauksessa); törmäyskaasu: typpi. PFAA:t mitattiin ohjelmoidussa monireaktion monitorointitilassa (sMRM). Tämä tila varmistaa korkean spesifisyyden ja herkkyyden kvantitatiivisissa analyyseissä. Ennen jokaista näyteerää suoritettiin järjestelmän soveltuvuustesti (AA-yhdisteiden standardiseoksen analyysi), jotta lämmitettiin ja tarkistettiin koko järjestelmän päivien välinen suorituskyky. Tiedonkeruu ja käsittely suoritettiin käyttämällä Analyst 1.5 -ohjelmistoa (Sciex). Kuvattu LC-ESI-MS/MS-menetelmä AA:iden määrittämiseen on vakiintunut Poznanin lääketieteellisen yliopiston epäorgaanisen ja analyyttisen kemian laitoksella, joka on hankkeen osatutkija (Dereziński et al. 2017, Hajduk et al. 2015, Klupczyńska ym. 2016, Matysiak ym. 2014).

Kokonaisverenkuva mitattiin Mythic 18 -laitteella (Orphée, Sveitsi). Kapillaariverinäytteet sormenpäästä (20 μl per näyte) otettiin samanaikaisesti laskimoveren kanssa ennen harjoitusta, sen aikana ja sen jälkeen. Veren laktaattipitoisuus mitattiin käyttämällä C-line-analysaattoria (EKF-Diagnostic, Saksa).