網膜色素変性症における球状間葉系幹細胞

眼科、アシバデム大学、医学部で、RP患者を対象に前向き臨床試験が実施されました。 この研究は、トルコ保健省の細胞、臓器および組織移植部門の審査委員会によって承認されました。 この研究は、ヘルシンキ宣言に従って実施されました。

患者の評価 RP の臨床的および遺伝的診断を受けた 15 人の患者が研究に含まれた。 患者は、最高矯正視力 (BCVA)、眼圧、前眼部検査、拡張眼底検査 (局所トロピカミド %1 およびフェニレフリン 2.5% を使用) を含む眼科検査を受けました。 各眼は、Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex（Carl Zeiss Meditec、ダブリン、カリフォルニア州、米国）、眼底自己蛍光および眼底フルオレセイン血管造影（Heidelberg Engineering、ドイツ）を使用したスペクトルドメインOCTスキャンを受けました。 Humphrey Field Analyzer モデル 750I (Carl Zeiss Meditec、米国カリフォルニア州ダブリン) を使用した 10-2 および 30-2 視野 (VF) テスト戦略の MD (平均偏差) および PSD (パターン標準偏差) パラメーターが取得されました。 電気生理学的機能は、International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) ガイドライン [27] に従って、mfERG 評価 (Monpack 3、Metrovision、France) で評価されました。 BCVA は、最小解像角 (logMAR) 相当の対数に変換されました。

1)緑内障、ブドウ膜炎、以前の硝子体網膜手術などの視力、視野および網膜の形態に影響を与える可能性のある共存する眼の病理学、2) mfERG、視野に影響を与える可能性のある共存する白内障、および/ 3) +6.00D よりも高い、-6.00D よりも低い測定値に影響を与える可能性がある屈折異常 4) 糖尿病、血管炎、リウマチ性疾患および慢性的な免疫抑制剤の使用などの視覚機能に影響を与える可能性のある全身性疾患の共存、5) 眼周囲への注射過去 6 か月間の多血小板血液および経角膜電気刺激の影響、および 6) 以前の眼科手術。

電気生理学的検査 トロピカミド 1% (Tropamid、Bilim ˙Ilaç、トルコ)、フェニレフリン 2.5% (Mydfrin、Alcon)、および塩酸プロパラカイン 0.5% (Alcaine、Alcon) を 1 滴塗布して、30 分間の暗順応と瞳孔拡張を行った後、ERG ジェット電極が配置されました。 瞳孔散大後に多焦点網膜電図を記録した。 刺激された網膜領域は、60° x 55°の領域に収まっていました。黒（5 cd/m2）と白（100 cd/m2）の刺激剤を交互に使用して、61 の六角刺激剤を使用しました。 同心リングは、International Society for Clinical Electrophysiology of Vision 規格に従って分析されました。 P1、N1、および N2 コンポーネントの振幅とレイテンシは、リングごとに記録されました。 黄斑（中央0°-2°）および周辺（2°-5°、5°-10°、10°-15°、および>15°）における多焦点網膜電図検査（mfERG）の平均信号振幅（MSA） ) 信号振幅の変化を個別に評価しました。

球状幹細胞の調製 第１継代の臍帯由来間葉系幹細胞は、ＧＭＰ（適正製造基準）条件を提供するLabcell Cellular Laboratory Centerから入手した。

スフェロイドの生産 スフェロイドの生産は GMP 条件で継続されました。 最初の通路の臍帯由来間葉系幹細胞は、スフェロイドの生産に使用されました。 100,000個の間葉系幹細胞を100μlで懸濁した。 %1 シプロフロキサシン (Polipharma) を含む無血清培地 (MSC NutriStem® XF Medium、Sartorius)。 低付着96ウェルプレートの各ウェルに、100μl中100,000個の細胞を播種した。 中くらい。 細胞を37℃で48時間インキュベートした。 48 時間後、すべてのスフェロイドをマイクロピペットで収集し、1% HSA (csl behring) を含む乳酸リンゲル液 (Osel/ Biofleks) に移しました。 スフェロイドを、１％ＨＡＳを含有する乳酸リンゲル溶液（ｃｓｌ ｂｅｈｒｉｎｇ）で３回洗浄した。 1 人の患者に対して 50 個のスフェロイドが作成されました (5x106 細胞を含む 50 個のスフェロイドが作成されました)。 50 個のスフェロイドのうち 5 個が品質管理分析用に予約されました。 残りの 45 のスフェロイド膜はマトリックスに埋め込まれていました。

マトリックスの作製と細胞包埋培養 225 μl クリオプレシピテート + 22.5 μl カルシウム (ADEKA) + 2.5 μl トランスアミン (Haver) を含むマトリックス混合物を 96 ウェル プレートの各ウェルに加えました。 マトリックスが半固体になったら、45 個のスフェロイドをマトリックスの中央に埋め込み、37 °C で 45 分間インキュベートしました。 45 分後に完全に固化したマトリックスをメスで取り出し、1% HAS を含む乳酸リンゲル液 (Osel/Biofleks) (csl behring) に移し、この溶液に入れて手術室に移しました (図1)。

品質管理分析 微生物学的血液培養、真菌、エンドトキシン分析および純度 (シプロフロキサシン <0.1 µg/ml)、効率 (脂肪細胞および軟骨分化分析) 細胞数/生存率およびフローサイトメトリー分析 (CD34 <%2、CD45 <%4 、CD90 >%80、HLA-DR <%4、CD105 >%60、CD73 >%70) は、品質管理分析のために予約されたスフェロイドから研究されました。

手術手技 患者は全身麻酔下で手術を受けた。 下側頭象限が手術領域として選択されました。 6.0 シルクは、輪部近くの 4 時から 5 時の間のアンカー縫合糸として使用されました。 結膜およびほぞは、輪部に平行な輪部から 6 mm のところに長さ 6 mm の切り込みを入れ、切り込みの縁を後方に 3 mm 進めました。 2 つの 8.0 vicryl 縫合糸は、結膜の前角で牽引縫合糸として使用されました。 ほぞは、強膜の後方で解剖された。 次に、7x7 の強膜皮弁を行いました。 強膜皮弁の前縁は、縁から 8 mm の位置に、縁に平行に 30 度の眼科用ナイフで作成されました。 外直筋と平行な基部を持つ U 字型のフラップを作成するために、別の 2 つの半分の厚さのサイド カットが作成されました。 次に、下前縁から始めて、三日月形の刃で深い強膜フラップを切開しました。 解剖中、フラップベッドの表面全体に黒い脈絡膜反射が観察されるはずです。 球状幹細胞を運ぶフィブリンプラグは、薄い強膜の下に見られる脈絡膜の上に配置されました。 それは強膜皮弁で覆われ、皮弁は 7.0 vicryl 縫合糸で端から元の位置に縫合されました。 テノンと結膜は、8.0 ビクリル縫合糸で別々に閉じられました。