Sferoidalne mezenchymalne komórki macierzyste w barwnikowym zwyrodnieniu siatkówki

Prospektywne badanie kliniczne przeprowadzono u pacjentów z RP na oddziale okulistyki Akademii Medycznej Acibadem University. Badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Rewizyjną Departamentu Transplantacji Komórek, Narządów i Tkanek tureckiego Ministerstwa Zdrowia. Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską.

Ocena pacjentów Do badania włączono piętnastu pacjentów z rozpoznaniem klinicznym i genetycznym RP. Pacjenci zostali poddani badaniu okulistycznemu, w tym najlepszej skorygowanej ostrości wzroku (BCVA), ciśnieniu wewnątrzgałkowemu, badaniu przedniego odcinka oka oraz badaniu poszerzonego dna oka (z miejscowym tropikamidem %1 i fenylefryną 2,5%). Każde oko zostało poddane skanowaniu OCT w domenie spektralnej za pomocą Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), autofluorescencji dna oka i angiografii fluoresceinowej dna oka (Heidelberg Engineering, Niemcy). Otrzymano parametry MD (odchylenie średnie) i PSD (odchylenie standardowe wzorca) strategii testowania pola widzenia (VF) 10-2 i 30-2 za pomocą Humphrey Field Analyzer model 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA). Funkcję elektrofizjologiczną oceniano metodą mfERG (Monpack 3, Metrovision, Francja) zgodnie z wytycznymi International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. BCVA przeliczono na logarytm ekwiwalentu minimalnego kąta rozdzielczości (logMAR).

Pacjenci zostali wykluczeni z badania, jeśli mieli 1) współistniejące patologie narządu wzroku, które mogą wpływać na ostrość wzroku, pole widzenia i morfologię siatkówki, takie jak jaskra, zapalenie błony naczyniowej oka, przebyta operacja witreoretinalna, 2) współistniejąca zaćma, która może wpływać na mfERG, pole widzenia i/lub lub obrazowania ocznego, 3) wada refrakcji, która może wpływać na pomiary powyżej +6,00D, poniżej -6,00D, 4) współistniejące choroby ogólnoustrojowe, które mogą wpływać na funkcje widzenia, takie jak cukrzyca, zapalenie naczyń, choroby reumatologiczne oraz przewlekłe stosowanie immunosupresyjne, 5) iniekcja okołogałkowa krwi bogatopłytkowej i przezrogówkowej stymulacji elektrycznej w ciągu ostatnich 6 miesięcy oraz 6) przebyta operacja oka.

Testy elektrofizjologiczne Po 30 minutach adaptacji do ciemności i rozszerzenia źrenic za pomocą jednej kropli tropikamidu 1% (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turcja), fenylefryny 2,5% (Mydfrin, Alcon) i chlorowodorku proparakainy 0,5% (Alcaine, Alcon) , umieszczono elektrody strumieniowe ERG. Wieloogniskowe elektroretinografie rejestrowano po rozszerzeniu źrenic. Stymulowany obszar siatkówki pokrywano w obszarze 60° x 55°; Zastosowano 61 sześciokątnych stymulantów z naprzemiennymi stymulantami czarnymi (5 cd/m2) i białymi (100 cd/m2). Koncentryczne pierścienie analizowano zgodnie ze standardami Międzynarodowego Towarzystwa Elektrofizjologii Klinicznej Widzenia.13 Amplitudę i opóźnienia składowych P1, N1 i N2 rejestrowano dla każdego pierścienia. Średnie amplitudy sygnału (MSA) elektroretinografii wieloogniskowej (mfERG) w plamce żółtej (centralna 0°-2°) i obwodowej (2°-5°,5°-10°, 10°-15° i >15° ) zmiany amplitudy sygnału oceniano oddzielnie.

Przygotowanie sferoidalnych komórek macierzystych Mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pierwszego pasażu pochodzące z pępowiny uzyskano z Labcell Cellular Laboratory Center, które zapewnia warunki GMP (dobrej praktyki produkcyjnej).

Produkcja sferoidów Produkcja sferoidów była kontynuowana w warunkach GMP. Do produkcji sferoid wykorzystano mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z pierwszego pasażu pępowiny. 100 000 mezenchymalnych komórek macierzystych zawieszono w 100 μl. Pożywka bez surowicy (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) zawierająca %1 cyprofloksacyny (Polipharma). Każdą studzienkę 96-studzienkowej płytki o niskim przyleganiu zaszczepiono 100 000 komórek w 100 μl. średni. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Po 48 godzinach wszystkie sferoidy zebrano mikropipetą i przeniesiono do roztworu mleczanu Ringera (Osel/Biofleks) zawierającego 1% HSA (csl behring). Sferoidy przemyto 3 razy roztworem mleczanu Ringera zawierającym 1% HAS (csl behring). Dla jednego pacjenta wytworzono 50 sferoid (wytworzono 50 sferoid zawierających 5x106 komórek). 5 z 50 sferoid zarezerwowano do analizy kontroli jakości. Pozostałe 45 błon sferoidalnych zostało osadzonych w matrycy.

Wytwarzanie macierzy i osadzanie w komórkach Hodowla Mieszaninę macierzy zawierającą 225 ul krioprecypitatu + 22,5 ul wapnia (Adeka) + 2,5 ul transaminy (Haver) dodano do każdej studzienki z 96-studzienkowych płytek. Gdy matryca stała się półstała, 45 sferoidów osadzono w środku matrycy i inkubowano w temperaturze 37 ° C przez 45 minut. Całkowicie zestaloną matrycę usunięto skalpelem, przeniesiono do mleczanowego roztworu Ringera (Osel/Biofleks) zawierającego 1% HAS (csl behring) i w tym roztworze przeniesiono na salę operacyjną (ryc. 1).

Analiza kontroli jakości Mikrobiologiczne posiewy krwi, grzyby, analiza endotoksyn i czystość (cyprofloksacyna <0,1 µg/ml), wydajność (analiza różnicowania adipocytów i chrząstek) Liczba/żywotność komórek i analiza metodą cytometrii przepływowej (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) zbadano z sferoid zarezerwowanych do analiz kontroli jakości.

Technika operacyjna Pacjenci byli operowani w znieczuleniu ogólnym. Jako pole operacyjne wybrano kwadrant dolnoskroniowy. Jedwab 6.0 zastosowano jako szew kotwiący w pobliżu rąbka między godziną 4 a 5. Spojówkę i czop otwarto jako cięcie o długości 6 mm w odległości 6 mm od rąbka równolegle do rąbka, a krawędzie nacięcia wysunięto 3 mm do tyłu. Jako szwy trakcyjne zastosowano dwa szwy vicrylowe 8,0 w przednich kącikach spojówki. Czop został wypreparowany nad twardówką z tyłu. Następnie wykonaliśmy płat twardówki 7x7. Przedni brzeg płatka twardówki utworzono w odległości 8 mm od rąbka, równolegle do rąbka za pomocą noża okulistycznego ustawionego pod kątem 30 stopni. Wykonano dwa inne nacięcia boczne o połowie grubości, aby utworzyć klapę w kształcie litery U, której podstawa jest równoległa do bocznego mięśnia prostego. Następnie zaczynając od dolno-przedniej krawędzi, za pomocą półksiężycowatego ostrza wypreparowano głęboki płat twardówki. Podczas preparowania należy obserwować czarny odruch naczyniówkowy na całej powierzchni łożyska płata. Wkładkę fibrynową zawierającą sferoidalne komórki macierzyste umieszczono na naczyniówce widocznej pod cienką twardówką. Zostało ono przykryte płatem twardówki, który został przyszyty do pierwotnego położenia od brzegów szwem vicrylowym 7,0. Czop i spojówkę zamknięto oddzielnie szwem vicrylowym 8,0.