Sphäroidale mesenchymale Stammzellen bei Retinitis pigmentosa

Eine prospektive klinische Studie wurde bei Patienten mit RP an der Abteilung für Augenheilkunde der medizinischen Fakultät der Acibadem-Universität durchgeführt. Die Studie wurde vom Review Board of Cell, Organ and Tissue Transplantation Department des türkischen Gesundheitsministeriums genehmigt. Die Studie wurde in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Patientenbewertung Fünfzehn Patienten mit klinischen und genetischen Diagnosen von RP wurden in die Studie aufgenommen. Die Patienten wurden einer augenärztlichen Untersuchung unterzogen, einschließlich bestkorrigierter Sehschärfe (BCVA), Augeninnendruck, Untersuchung des vorderen Segments und Untersuchung des erweiterten Fundus (mit topischem Tropicamid %1 und Phenylephrin 2,5 %). Jedes Auge wurde einem Spektraldomänen-OCT-Scannen mit Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), Fundus-Autofluoreszenz und Fundus-Fluoreszein-Angiographie (Heidelberg Engineering, Deutschland) unterzogen. MD (mittlere Abweichung) und PSD (Musterstandardabweichung) Parameter von 10 –2 und 30 –2 Gesichtsfeld (VF) Teststrategien mit einem Humphrey Field Analyzer Modell 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA) wurden erhalten. Die elektrophysiologische Funktion wurde mit mfERG-Evaluierung (Monpack 3, Metrovision, Frankreich) gemäß den Richtlinien der International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) bewertet [27]. BCVA wurde in den Logarithmus des Äquivalents des minimalen Auflösungswinkels (logMAR) umgewandelt.

Die Patienten wurden aus der Studie ausgeschlossen, wenn sie 1) eine gleichzeitig bestehende Augenpathologie hatten, die die Sehschärfe, das Gesichtsfeld und die Morphologie der Netzhaut beeinträchtigen kann, wie z. oder okuläre Bildgebung, 3) Refraktionsfehler, der Messungen über +6,00 dpt und unter -6,00 dpt beeinflussen kann, 4) gleichzeitig bestehende systemische Erkrankungen, die die Sehfunktion beeinträchtigen können, wie Diabetes, Vaskulitis, rheumatologische Erkrankungen und chronische Anwendung von Immunsuppressiva, 5) periokulare Injektion von plättchenreichem Blut und transkornealer elektrischer Stimulation in den letzten 6 Monaten und 6) frühere Augenoperationen.

Elektrophysiologischer Test Nach 30 Minuten Dunkeladaptation und Pupillenerweiterung durch Auftragen von einem Tropfen Tropicamid 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Türkei), Phenylephrin 2,5 % (Mydfrin, Alcon) und Proparacainhydrochlorid 0,5 % (Alcaine, Alcon) wurden ERG-Jet-Elektroden platziert. Multifokale Elektroretinographien wurden nach Pupillenerweiterung aufgezeichnet. Der stimulierte Netzhautbereich wurde in einem Bereich von 60° x 55° subtensiert; 61 Hexagon-Stimulanzien wurden mit abwechselnd schwarzen (5 cd/m2) und weißen (100 cd/m2) Stimulanzien verwendet. Die konzentrischen Ringe wurden gemäß den Standards der International Society for Clinical Electrophysiology of Vision analysiert.13 Die Amplitude und Latenzen der P1-, N1- und N2-Komponenten wurden für jeden Ring aufgezeichnet. Die mittleren Signalamplituden (MSA) der multifokalen Elektroretinographie (mfERG) in der Makula (zentral 0°-2°) und peripher (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° und >15°). ) Signalamplitudenänderungen wurden separat ausgewertet.

Präparation kugelförmiger Stammzellen Aus der Nabelschnur stammende mesenchymale Stammzellen der ersten Passage wurden vom Labcell Cellular Laboratory Center erhalten, das GMP-Bedingungen (gute Herstellungspraxis) bereitstellt.

Sphäroid-Produktion Die Sphäroid-Produktion wurde unter GMP-Bedingungen fortgesetzt. Aus der Nabelschnur stammende mesenchymale Stammzellen der ersten Passage wurden zur Herstellung von Sphäroiden verwendet. 100.000 mesenchymale Stammzellen wurden mit 100 μl suspendiert. Serumfreies Medium (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) mit %1 Ciprofloxacin (Polipharma). Jede Vertiefung der 96-Well-Platte mit niedriger Anhaftung wurde mit 100.000 Zellen in 100 &mgr;l ausgesät. Mittel. Die Zellen wurden 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende von 48 Stunden wurden alle Sphäroide mit einer Mikropipette gesammelt und in Ringer-Laktatlösung (Osel/Biofleks), die 1 % HSA (csl Behring) enthielt, überführt. Sphäroide wurden dreimal mit Ringer-Lactatlösung gewaschen, die 1 % HAS (csl Behring) enthielt. 50 Sphäroide wurden für einen Patienten hergestellt (50 Sphäroide, die 5 × 10 6 Zellen enthielten, wurden hergestellt). 5 von 50 Sphäroiden wurden für die Qualitätskontrollanalyse reserviert. Die verbleibenden 45 Sphäroidmembranen wurden in die Matrix eingebettet.

Matrixherstellung und Zelleinbettungskultur Matrixmischung, die 225 &mgr;l Kryopräzipitat + 22,5 &mgr;l Calcium (Adeka) + 2,5 &mgr;l Transamin (Haver) enthielt, wurde zu jeder Vertiefung der 96-Well-Platten gegeben. Als die Matrix halbfest wurde, wurden 45 Sphäroide in die Mitte der Matrix eingebettet und 45 min lang bei 37 °C inkubiert. Die nach 45 Minuten vollständig verfestigte Matrix wurde mit Hilfe eines Skalpells entfernt, in Ringer-Laktat-Lösung (Osel/ Biofleks) mit 1 % HAS (csl Behring) überführt und in dieser Lösung in den Operationssaal überführt (Abb 1).

Qualitätskontrolle Analyse Mikrobiologische Blutkultur, Pilz-, Endotoxinanalyse und Reinheit (Ciprofloxacin <0,1 µg/ml), Effizienz (Adipozyten- und Knorpeldifferenzierungsanalyse) Zellzahl/Lebensfähigkeit und durchflusszytometrische Analyse (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 > % 80, HLA-DR < % 4, CD105 > % 60, CD73 > % 70) wurden von den reservierten Sphäroiden für Qualitätskontrollanalysen untersucht.

Operationstechnik Die Patienten wurden unter Vollnarkose operiert. Als Operationsgebiet wurde der inferotemporale Quadrant gewählt. 6,0 Seide wurde als Verankerungsnaht in der Nähe des Limbus zwischen 4 und 5 Uhr verwendet. Bindehaut und Zapfen wurden als 6 mm langer Schnitt bei 6 mm vom Limbus parallel zum Limbus geöffnet, und die Ränder des Schnitts wurden 3 mm nach hinten vorgeschoben. Als Zugnähte an den vorderen Ecken der Bindehaut wurden zwei 8,0-Vicryl-Nähte verwendet. Der Zapfen wurde posterior über der Sklera präpariert. Dann führten wir einen 7x7 Skleralappen durch. Der vordere Rand des Skleralappens wurde bei 8 mm vom Limbus parallel zum Limbus mit einem 30-Grad-Augenmesser erzeugt. Zwei weitere Seitenschnitte halber Dicke wurden vorgenommen, um einen U-förmigen Lappen zu erzeugen, dessen Basis parallel zum lateralen Rectus-Muskel liegt. Dann wurde ausgehend von der infero-anterioren Kante ein tiefer Skleralappen mit einer Halbmondklinge präpariert. Während der Dissektion sollte der schwarze Aderhautreflex rund um die Oberfläche des Lappenbetts beobachtet werden. Der Fibrinpfropfen, der kugelförmige Stammzellen trug, wurde über der Aderhaut platziert, die unter der dünnen Sklera zu sehen war. Er wurde durch den Skleralappen abgedeckt und der Lappen wurde von seinen Rändern mit einer 7,0-Vicryl-Naht an seine ursprüngliche Position genäht. Zapfen und Bindehaut wurden separat mit einer 8,0-Vicryl-Naht verschlossen.