Сфероидальные мезенхимальные стволовые клетки при пигментном ретините

Проспективное клиническое исследование было проведено у пациентов с РП на кафедре офтальмологии Медицинской школы Университета Аджибадем. Исследование было одобрено Наблюдательным советом Департамента трансплантации клеток, органов и тканей Министерства здравоохранения Турции. Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Оценка пациентов В исследование были включены пятнадцать пациентов с клиническим и генетическим диагнозом РП. Пациентам было проведено офтальмологическое обследование, включая максимально корригированную остроту зрения (BCVA), внутриглазное давление, исследование переднего сегмента и расширенное исследование глазного дна (с местным тропикамидом %1 и фенилэфрином 2,5%). Каждый глаз прошел ОКТ-сканирование спектральной области с помощью Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Дублин, Калифорния, США), аутофлуоресценцию глазного дна и флуоресцентную ангиографию глазного дна (Heidelberg Engineering, Германия). Были получены параметры MD (среднее отклонение) и PSD (стандартное отклонение шаблона) стратегий тестирования поля зрения (VF) 10-2 и 30-2 с помощью анализатора поля зрения Humphrey Field Analyzer модели 750I (Carl Zeiss Meditec, Дублин, Калифорния, США). Электрофизиологическую функцию оценивали с помощью mfERG (Monpack 3, Metrovision, Франция) в соответствии с рекомендациями Международного общества клинической электрофизиологии зрения (ISCEV) [27]. BCVA была преобразована в логарифм эквивалента минимального угла разрешения (logMAR).

Пациенты были исключены из исследования, если у них была 1) сопутствующая глазная патология, которая может повлиять на остроту зрения, поле зрения и морфологию сетчатки, такая как глаукома, увеит, предшествующая витреоретинальная хирургия, 2) сосуществующая катаракта, которая может повлиять на mfERG, поле зрения и / или визуализация глаза, 3) аномалия рефракции, которая может повлиять на измерения выше +6,00 дптр, ниже -6,00 дптр 4) сопутствующие системные заболевания, которые могут повлиять на зрительную функцию, такие как диабет, васкулит, ревматологические заболевания и хроническое иммуносупрессивное использование, 5) периокулярная инъекция крови, богатой тромбоцитами, и транскорнеальной электростимуляции в предыдущие 6 месяцев и 6) предшествующей операции на глазах.

Электрофизиологическое тестирование После 30-минутной темновой адаптации и расширения зрачка с применением одной капли 1% тропамида (Тропамид, Bilim ˙Ilaç, Турция), фенилэфрина 2,5% (Мидфрин, Алкон) и гидрохлорида пропаракаина 0,5% (Алкаин, Алкон) , установлены струйные электроды ЭРГ. После расширения зрачка регистрировали мультифокальную электроретинографию. Стимулируемая область сетчатки располагалась в области 60° х 55°; Использовался 61 шестиугольный стимулятор с чередованием черных (5 кд/м2) и белых (100 кд/м2) стимуляторов. Концентрические кольца анализировали в соответствии со стандартами Международного общества клинической электрофизиологии зрения.13 Для каждого кольца регистрировали амплитуду и латентность компонентов P1, N1 и N2. Средние амплитуды сигнала (СМА) мультифокальной электроретинографии (мфЭРГ) в макуле (центральная 0°-2°) и периферическая (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° и >15°) ) изменения амплитуды сигнала оценивались отдельно.

Подготовка сфероидальных стволовых клеток. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из пуповины первого пассажа, были получены из Лабораторного центра Labcell Cellular, который обеспечивает условия GMP (надлежащая производственная практика).

Производство сфероидов Продолжалось производство сфероидов в соответствии с требованиями GMP. Для получения сфероидов использовали мезенхимальные стволовые клетки первого пассажа, полученные из пуповины. 100 000 мезенхимальных стволовых клеток суспендировали в 100 мкл. Бессывороточная среда (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius), содержащая 1% ципрофлоксацина (Polipharma). В каждую лунку 96-луночного планшета с низким прикреплением засевали 100000 клеток в 100 мкл. середина. Клетки инкубировали при 37°С в течение 48 часов. По истечении 48 часов все сфероиды собирали микропипеткой и переносили в раствор лактата Рингера (Osel/Biofleks), содержащий 1% HSA (csl behring). Сфероиды промывали 3 раза лактатным раствором Рингера, содержащим 1% HAS (csl behring). На одного пациента было изготовлено 50 сфероидов (получено 50 сфероидов, содержащих 5х106 клеток). 5 из 50 сфероидов были зарезервированы для анализа контроля качества. Остальные 45 сфероидных мембран были встроены в матрикс.

Получение матрицы и встраивание клеток Культуральная смесь матрицы, содержащая 225 мкл криопреципитата + 22,5 мкл кальция (Adeka) + 2,5 мкл трансамина (Haver), добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Когда матрица становилась полутвердой, в середину матрицы помещали 45 сфероидов и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. Матрикс, полностью затвердевший через 45 минут, удаляли с помощью скальпеля, переводили в лактатный раствор Рингера (Осел/Биофлекс), содержащий 1% ГАС (csl behring), и в этом растворе переносили в операционную (рис. 1).

Анализ контроля качества Микробиологический посев крови, анализ на грибки, эндотоксины и чистота (ципрофлоксацин <0,1 мкг/мл), эффективность (анализ дифференцировки адипоцитов и хрящей) Количество клеток/жизнеспособность и проточный цитометрический анализ (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90>%80, HLA-DR <%4, CD105>%60, CD73>%70) были изучены из зарезервированных сфероидов для анализа контроля качества.

Хирургическая техника Больные оперированы под общей анестезией. В качестве зоны хирургического вмешательства был выбран нижневисочный квадрант. Шелк 6,0 использовали в качестве фиксирующего шва возле лимба между 4 и 5 часами. Конъюнктиву и сухожилие вскрывали разрезом длиной 6 мм на расстоянии 6 мм от лимба параллельно лимбу, а края разреза отодвигали на 3 мм кзади. В качестве швов-держалок на передние углы конъюнктивы накладывали две викриловые нити 8,0. Тенон рассекали над склерой кзади. Затем мы выполнили склеральный лоскут 7х7. Передний край склерального лоскута формировали на расстоянии 8 мм от лимба параллельно лимбу офтальмологическим ножом под углом 30 градусов. Два других боковых разреза на половину толщины были сделаны для создания U-образного лоскута, основание которого параллельно латеральной прямой мышце. Затем, начиная с нижне-переднего края, серповидным лезвием рассекали глубокий склеральный лоскут. Во время вскрытия должен наблюдаться черный хориоидальный рефлекс по всей поверхности ложа лоскута. Фибриновая пробка, несущая сфероидальные стволовые клетки, была помещена над сосудистой оболочкой, которая была видна под тонкой склерой. Он был укрыт склеральным лоскутом и лоскут подшит к исходному положению с его краев викриловой нитью 7,0. Тенон и конъюнктиву ушивают отдельно викриловой нитью 8,0.