Cellules souches mésenchymateuses sphéroïdales dans la rétinite pigmentaire

Un essai clinique prospectif a été mené chez des patients atteints de RP au département d'ophtalmologie de l'Université Acibadem, faculté de médecine. L'étude a été approuvée par le comité d'examen du département de transplantation de cellules, d'organes et de tissus du ministère turc de la Santé. L'étude a été réalisée conformément à la Déclaration d'Helsinki.

Évaluation des patients Quinze patients avec des diagnostics cliniques et génétiques de RP ont été inclus dans l'étude. Les patients ont subi un examen ophtalmologique comprenant la meilleure acuité visuelle corrigée (MAVC), la pression intraoculaire, un examen du segment antérieur et un examen du fond d'œil dilaté (avec tropicamide topique %1 et phényléphrine 2,5 %). Chaque œil a subi un balayage OCT du domaine spectral avec Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, Californie, États-Unis), une autofluorescence du fond d'œil et une angiographie à la fluorescéine du fond d'œil (Heidelberg Engineering, Allemagne). Les paramètres MD (écart moyen) et PSD (écart type de modèle) des stratégies de test de champ visuel (VF) 10-2 et 30-2 avec un Humphrey Field Analyzer modèle 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA) ont été obtenus. La fonction électrophysiologique a été évaluée avec l'évaluation mfERG (Monpack 3, Metrovision, France) selon les directives de l'International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. La BCVA a été convertie en logarithme de l'équivalent de l'angle minimal de résolution (logMAR).

Les patients ont été exclus de l'étude s'ils avaient 1) une pathologie oculaire coexistante pouvant affecter l'acuité visuelle, le champ visuel et la morphologie rétinienne comme le glaucome, l'uvéite, une chirurgie vitréorétinienne antérieure, 2) une cataracte coexistante pouvant affecter le mfERG, le champ visuel et/ ou imagerie oculaire, 3) erreur de réfraction pouvant affecter les mesures supérieures à +6,00D, inférieures à -6,00D 4) maladies systémiques coexistantes pouvant affecter la fonction visuelle telles que le diabète, la vascularite, les maladies rhumatologiques et l'utilisation immunosuppressive chronique, 5) injection périoculaire de sang riche en plaquettes et de stimulation électrique transcornéenne au cours des 6 mois précédents et 6) chirurgie oculaire antérieure.

Test électrophysiologique Après 30 minutes d'adaptation à l'obscurité et de dilatation de la pupille avec l'application d'une goutte de tropicamide 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turquie), de phényléphrine 2,5 % (Mydfrin, Alcon) et de chlorhydrate de proparacaïne 0,5 % (Alcaine, Alcon) , des électrodes à jet ERG ont été placées. Des électrorétinographies multifocales ont été enregistrées après dilatation pupillaire. La zone rétinienne stimulée était sous-tendue dans une zone de 60° x 55° ; 61 stimulants hexagonaux ont été utilisés avec une alternance de stimulants noirs (5 cd/m2) et blancs (100 cd/m2). Les anneaux concentriques ont été analysés selon les normes de l'International Society for Clinical Electrophysiology of Vision.13 L'amplitude et les latences des composantes P1, N1 et N2 ont été enregistrées pour chaque anneau. Les amplitudes moyennes du signal (MSA) de l'électrorétinographie multifocale (mfERG) dans la macula (centrale 0°-2°) et la périphérie (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° et >15° ) les changements d'amplitude du signal ont été évalués séparément.

Préparation des cellules souches sphéroïdales Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical de premier passage ont été obtenues auprès du Labcell Cellular Laboratory Center qui fournit des conditions GMP (bonnes pratiques de fabrication).

Production de sphéroïdes La production de sphéroïdes s'est poursuivie dans des conditions GMP. Des cellules souches mésenchymateuses dérivées du cordon ombilical de premier passage ont été utilisées dans la production de sphéroïdes. 100 000 cellules souches mésenchymateuses ont été mises en suspension avec 100 μl. Milieu sans sérum (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) contenant %1 de ciprofloxacine (Polipharma). Chaque puits de la plaque à 96 puits à faible attachement a été ensemencé avec 100 000 cellules dans 100 μl. moyen. Les cellules ont été incubées à 37°C pendant 48 heures. Au bout de 48 heures, tous les sphéroïdes ont été collectés avec une micropipette et transférés dans une solution de lactate de Ringer (Osel/ Biofleks) contenant 1 % de HSA (csl behring). Les sphéroïdes ont été lavés 3 fois avec une solution de lactate de Ringer contenant 1 % de HAS (csl behring). 50 sphéroïdes ont été produits pour un patient (50 sphéroïdes contenant 5x106 cellules ont été produits). 5 des 50 sphéroïdes ont été réservés pour l'analyse de contrôle de qualité. Les 45 membranes sphéroïdes restantes ont été intégrées dans la matrice.

Production de matrice et culture d'inclusion de cellules Un mélange de matrice contenant 225 µl de cryoprécipité + 22,5 µl de calcium (Adeka) + 2,5 µl de transamine (Haver) a été ajouté à chaque puits des plaques à 96 puits. Lorsque la matrice est devenue semi-solide, 45 sphéroïdes ont été intégrés au milieu de la matrice et incubés à 37 ° C pendant 45 min. La matrice, devenue complètement solide après 45 minutes, a été retirée à l'aide d'un scalpel, transférée dans une solution de lactate de Ringer (Osel/ Biofleks) contenant 1 % d'HAS (csl behring), et transférée au bloc opératoire dans cette solution (Figure 1).

Analyse de contrôle de qualité Hémoculture microbiologique, analyse fongique, endotoxine et pureté (ciprofloxacine <0,1 µg/ml), efficacité (analyse de la différenciation des adipocytes et du cartilage) Numération cellulaire/Viabilité et analyse par cytométrie en flux (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90>% 80, HLA-DR <% 4, CD105>% 60, CD73>% 70) ont été étudiés à partir des sphéroïdes réservés pour les analyses de contrôle de qualité.

Technique chirurgicale Les patients ont été opérés sous anesthésie générale. Le quadrant inférotemporal a été choisi comme zone chirurgicale. La soie 6.0 a été utilisée comme suture d'ancrage près du limbe entre 4 et 5 heures. La conjonctive et le tenon ont été ouverts comme une coupe de 6 mm de long à 6 mm du limbe parallèlement au limbe et les bords de la coupe ont été avancés de 3 mm vers l'arrière. Deux sutures vicryl 8.0 ont été utilisées comme sutures de traction aux coins antérieurs de la conjonctive. Le tenon a été disséqué sur la sclérotique en arrière. Puis nous avons réalisé un lambeau scléral 7x7. La marge antérieure du lambeau scléral a été créée à 8 mm du limbe, parallèlement au limbe avec un couteau ophtalmique à 30 degrés. Deux autres coupes latérales en demi-épaisseur ont été réalisées pour créer un lambeau en forme de U dont la base est parallèle au muscle droit latéral. Puis à partir du bord inféro-antérieur, un lambeau scléral profond a été disséqué avec une lame en croissant. Pendant la dissection, un réflexe choroïdien noir doit être observé tout autour de la surface du lit du lambeau. Le bouchon de fibrine portant des cellules souches sphéroïdales a été placé sur la choroïde visible sous la fine sclérotique. Il a été recouvert par le lambeau scléral et le lambeau a été suturé à sa position d'origine à partir de ses bords avec une suture vicryl 7,0. Le tenon et la conjonctive ont été fermés séparément avec une suture vicryl 8.0.