Sferoidiset mesenkymaaliset kantasolut retinitis Pigmentosassa

Prospektiivinen kliininen tutkimus suoritettiin potilailla, joilla oli RP, Acibademin yliopiston lääketieteellisen koulun oftalmologian osastolla. Tutkimuksen hyväksyi Turkin terveysministeriön solu-, elin- ja kudossiirtoosaston arviointilautakunta. Tutkimus tehtiin Helsingin julistuksen mukaisesti.

Potilasarviointi Tutkimukseen osallistui 15 potilasta, joilla oli kliininen ja geneettinen RP-diagnoosi. Potilaille tehtiin oftalminen tutkimus, johon sisältyi paras korjattu näöntarkkuus (BCVA), silmänsisäinen paine, etuosan tutkimus ja laajentuneen silmänpohjan tutkimus (paikallista tropikamidia % 1 ja fenyyliefriiniä 2,5 %). Jokaiselle silmälle tehtiin spektrialueen OCT-skannaus Cirrus 5000 HD-OCT Angioplexillä (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), silmänpohjan autofluoresenssi ja silmänpohjan fluoreseiiniangiografia (Heidelberg Engineering, Saksa). Saatiin MD (keskipoikkeama) ja PSD (mallin standardipoikkeama) parametrit 10-2 ja 30-2 näkökentän (VF) testausstrategioista Humphrey Field Analyzer -mallilla 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA). Sähköfysiologinen toiminta arvioitiin mfERG-arvioinnilla (Monpack 3, Metrovision, Ranska) International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) -ohjeiden mukaisesti [27]. BCVA muutettiin minimaalisen resoluution kulman (logMAR) logaritmiksi.

Potilaat suljettiin pois tutkimuksesta, jos heillä oli 1) samanaikainen silmäsairaus, joka voi vaikuttaa näöntarkkuuteen, näkökenttään ja verkkokalvon morfologiaan, kuten glaukooma, uveiitti, edellinen lasiaisten silmäleikkaus, 2) rinnakkainen kaihi, joka saattaa vaikuttaa mfERG:hen, näkökenttään ja/ tai silmän kuvantaminen, 3) taittovirhe, joka voi vaikuttaa mittauksiin yli +6,00 D, alle -6,00 D 4) rinnakkaiset systeemiset sairaudet, jotka voivat vaikuttaa näkötoimintoihin, kuten diabetes, vaskuliitti, reumatologiset sairaudet ja krooninen immunosuppressiivinen käyttö, 5) silmän ympärille annettava injektio verihiutalepitoisesta verestä ja transsarveiskalvon sähköstimulaatiosta edellisten 6 kuukauden aikana ja 6) aiempi silmäleikkaus.

Sähköfysiologinen testaus 30 minuutin pimeyteen sopeutumisen ja pupillien laajentamisen jälkeen käyttämällä yksi tippa tropikamidia 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turkki), fenyyliefriiniä 2,5 % (Mydfrin, Alcon) ja proparakaiinihydrokloridia 0,5 % (Alcaine, Alcon) , ERG-suihkuelektrodit asetettiin. Multifokaaliset elektroretinografiat rekisteröitiin pupillien laajentamisen jälkeen. Stimuloitu verkkokalvon alue painettiin 60° x 55° alueelle; Käytettiin 61 kuusikulmaista stimulanttia vuorotellen mustien (5 cd/m2) ja valkoisten (100 cd/m2) stimulanttien kanssa. Samakeskiset renkaat analysoitiin International Society for Clinical Electrophysiology of Vision -standardien mukaisesti.13 P1-, N1- ja N2-komponenttien amplitudi ja latenssit kirjattiin jokaiselle renkaalle. Multifokaalisen elektroretinografian (mfERG) keskimääräiset signaalin amplitudit (MSA:t) makulassa (kesk. 0°-2°) ja perifeerisessä (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° ja >15°) ) signaalin amplitudin muutokset arvioitiin erikseen.

Palloisten kantasolujen valmistus Ensimmäisen siirrostuksen napanuorasta peräisin oleva mesenkymaalinen kantasolu saatiin Labcell Cellular Laboratory Centeristä, joka tarjoaa GMP-olosuhteet (hyvät valmistuskäytännöt).

Sferoidin tuotanto Sferoidin tuotanto jatkui GMP-tilassa. Ensimmäisen siirrostuksen napanuorasta peräisin olevia mesenkymaalisia kantasoluja käytettiin sferoidien tuotannossa. 100 000 mesenkymaalista kantasolua suspendoitiin 100 μl:aan. Seerumiton elatusaine (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius), joka sisältää %1 siprofloksasiinia (Polipharma). Matalakiinnittyneen 96-kuoppaisen levyn jokaiseen kuoppaan ympättiin 100 000 solua 100 μl:ssa. keskikokoinen. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tuntia. 48 tunnin kuluttua kaikki sferoidit kerättiin mikropipetillä ja siirrettiin Ringerin laktaattiliuokseen (Osel/Biofleks), joka sisälsi 1 % HSA:ta (csl behring). Sferoidit pestiin 3 kertaa Ringerin laktaattiliuoksella, joka sisälsi 1 % HAS:a (csl behring). Yhdelle potilaalle tuotettiin 50 sferoidia (tuotettiin 50 sferoidia, jotka sisälsivät 5 x 106 solua). 5 sferoidista 50:stä varattiin laadunvalvontaanalyysiin. Loput 45 pallomaista kalvoa upotettiin matriisiin.

Matriisin tuotanto ja solujen upotusviljelmä Matriksiseos, joka sisälsi 225 ui kryosaostetta + 22,5 ui kalsiumia (Adeka) + 2,5 ui transamiinia (Haver), lisättiin jokaiseen 96-kuoppaisten levyjen kuoppaan. Kun matriisista tuli puolikiinteä, 45 sferoidia upotettiin matriisin keskelle ja inkuboitiin 37 °C:ssa 45 minuuttia. 45 minuutin kuluttua täysin kiinteäksi muuttunut matriisi poistettiin skalpellin avulla, siirrettiin Ringerin laktaattiliuokseen (Osel/Biofleks), joka sisälsi 1 % HAS:ää (csl behring) ja siirrettiin leikkaussaliin tässä liuoksessa (kuva 1).

Laadunvalvontaanalyysi Mikrobiologinen veriviljely, sieni-, endotoksiinianalyysi ja puhtaus (siprofloksasiini <0,1 µg/ml), tehokkuus (rasvasolujen ja ruston erilaistumisanalyysi) Solumäärä/elinkyky ja virtaussytometrinen analyysi (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 > % 80, HLA-DR < % 4, CD105 > % 60, CD73 > % 70) tutkittiin laadunvalvontaanalyysejä varten varatuista sferoideista.

Kirurginen tekniikka Potilaille tehtiin leikkaus yleisanestesiassa. Inferotemporaalinen kvadrantti valittiin leikkausalueeksi. 6.0 silkkiä käytettiin ankkurointiompeleena lähellä limbusta kello 4 ja 5 välillä. Sidekalvo ja jänne avattiin 6 mm:n pituisena leikkauksena 6 mm:n etäisyydellä limbuksesta limbuksen suuntaisesti ja leikkauksen reunat siirrettiin 3 mm taaksepäin. Kaksi 8,0 vikryyliommelta käytettiin vetoompeleina sidekalvon etukulmissa. Tappi leikattiin kovakalvon yli takapuolelta. Sitten suoritimme 7x7 kovakalvoläpän. Kovakalvon läpän etureuna luotiin 8 mm:n päähän limbuksesta, yhdensuuntaisesti limbuksen kanssa 30 asteen silmäveitsellä. Kaksi muuta puolipaksuista sivuleikkausta tehtiin U-muotoisen läpän luomiseksi, jonka pohja on yhdensuuntainen lateraalisen suoralihaksen kanssa. Sitten infero-etureunasta alkaen leikattiin syvä kovakalvoläppä puolikuuterällä. Dissektion aikana mustaa suonikalvon refleksiä tulee tarkkailla koko läppäpatjan pinnalla. Pallomaisia ​​kantasoluja kantava fibriinitulppa asetettiin ohuen kovakalvon alla näkyvän suonikalvon päälle. Se peitettiin kovakalvoläpällä ja läppä ommeltiin alkuperäiseen asentoonsa reunoistaan ​​7,0 vikryyliompeleella. Tenon ja sidekalvo suljettiin erikseen 8,0 vikryyliompeleella.