Sféroidní mezenchymální kmenové buňky u retinitis Pigmentosa

Prospektivní klinická studie byla provedena u pacientů s RP na klinice oftalmologie, Acibadem University, Medical School. Studie byla schválena Revizní radou oddělení pro transplantaci buněk, orgánů a tkání tureckého ministerstva zdravotnictví. Studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací.

Hodnocení pacientů Do studie bylo zařazeno 15 pacientů s klinickou a genetickou diagnózou RP. Pacienti podstoupili oftalmologické vyšetření včetně nejlepší korigované zrakové ostrosti (BCVA), nitroočního tlaku, vyšetření předního segmentu a vyšetření dilatovaného fundu (s topickým tropikamidem %1 a fenylefrinem 2,5 %). Každé oko podstoupilo OCT skenování spektrální domény pomocí Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), autofluorescenci fundu a fluoresceinovou angiografii fundu (Heidelberg Engineering, Německo). Byly získány parametry MD (střední odchylka) a PSD (směrodatná odchylka vzoru) strategií testování zorného pole (VF) 10-2 a 30-2 pomocí Humphrey Field Analyzer model 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA). Elektrofyziologická funkce byla hodnocena hodnocením mfERG (Monpack 3, Metrovision, Francie) podle doporučení Mezinárodní společnosti pro klinickou elektrofyziologii vidění (ISCEV) [27]. BCVA byla převedena na logaritmus ekvivalentu minimálního úhlu rozlišení (logMAR).

Pacienti byli ze studie vyloučeni, pokud měli 1) koexistující oční patologii, která může ovlivnit zrakovou ostrost, zorné pole a morfologii sítnice, jako je glaukom, uveitida, předchozí vitreoretinální operace, 2) koexistující kataraktu, která může ovlivnit mfERG, zorné pole a/ nebo oční zobrazování, 3) refrakční vada, která může ovlivnit měření vyšší než +6,00D, nižší než -6,00D 4) souběžná systémová onemocnění, která mohou ovlivnit zrakové funkce, jako je diabetes, vaskulitida, revmatologická onemocnění a chronické imunosupresivní užívání, 5) periokulární injekce krve bohaté na krevní destičky a transkorneální elektrické stimulace v předchozích 6 měsících a 6) předchozí oční operaci.

Elektrofyziologické testování Po 30 minutách adaptace na tmu a dilataci zornice s aplikací jedné kapky tropikamidu 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turecko), fenylefrinu 2,5 % (Mydfrin, Alcon) a proparakain hydrochloridu 0,5 % (Alcaine, Alcon) , byly umístěny ERG proudové elektrody. Multifokální elektroretinografie byly zaznamenány po dilataci zornice. Stimulovaná oblast sítnice byla subtenována v oblasti 60° x 55°; Bylo použito 61 šestiúhelníkových stimulantů se střídajícími se černými (5 cd/m2) a bílými (100 cd/m2) stimulanty. Soustředné prstence byly analyzovány podle standardů International Society for Clinical Electrophysiology of Vision.13 Amplituda a latence složek P1, N1 a N2 byly zaznamenány pro každý prstenec. Střední amplitudy signálu (MSA) multifokální elektroretinografie (mfERG) v makule (centrální 0°-2°) a periferní (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° a >15° ) změny amplitudy signálu byly hodnoceny samostatně.

Příprava sféroidních kmenových buněk První pasáž mezenchymálních kmenových buněk odvozených z pupečníkové šňůry byla získána z Labcell Cellular Laboratory Center, které poskytuje podmínky GMP (správné výrobní postupy).

Výroba sféroidů Výroba sféroidů pokračovala za podmínek GMP. Při výrobě sféroidů byly použity mezenchymální kmenové buňky pocházející z první pasáže z pupečníku. 100 000 mezenchymálních kmenových buněk bylo suspendováno ve 100 μl. Médium bez séra (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) obsahující %1 ciprofloxacinu (Polipharma). Každá jamka 96jamkové destičky s nízkým připojením byla naočkována 100 000 buňkami ve 100 ul. střední. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 48 hodin. Na konci 48 hodin byly všechny sféroidy sebrány pomocí mikropipety a přeneseny do Ringerova laktátového roztoku (Osel/Biofleks) obsahujícího 1 % HSA (csl behring). Sféroidy byly 3krát promyty Ringerovým roztokem laktátu obsahujícím 1 % HAS (csl behring). Pro jednoho pacienta bylo vyrobeno 50 sféroidů (bylo vyrobeno 50 sféroidů obsahujících 5x106 buněk). 5 z 50 sféroidů bylo vyhrazeno pro analýzu kontroly kvality. Zbývajících 45 sféroidních membrán bylo zapuštěno do matrice.

Produkce matrice a kultivace zalití buněk Směs matrice obsahující 225 ul kryoprecipitátu + 22,5 ul vápníku (Adeka) + 2,5 ul transaminu (Haver) byla přidána do každé jamky 96jamkových destiček. Když se matrice stala polotuhou, 45 sféroidů bylo zapuštěno doprostřed matrice a inkubováno při 37 °C po dobu 45 minut. Matrice, která po 45 minutách zcela ztuhla, byla odstraněna pomocí skalpelu, přenesena do Ringerova laktátového roztoku (Osel/Biofleks) obsahujícího 1 % HAS (csl behring) a přenesena na operační sál v tomto roztoku (obr. 1).

Analýza kontroly kvality Mikrobiologická hemokultura, analýza hub, endotoxin a čistota (ciprofloxacin <0,1 µg/ml), účinnost (analýza diferenciace adipocytů a chrupavek) Počet/životaschopnost buněk a analýza průtokovou cytometrií (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) byly studovány z rezervovaných sféroidů pro analýzy kontroly kvality.

Operační technika Pacienti byli operováni v celkové anestezii. Jako operační oblast byl zvolen inferotemporální kvadrant. 6,0 hedvábí bylo použito jako kotvící steh poblíž limbu mezi 4. a 5. hodinou. Spojivka a čep byly otevřeny jako 6 mm dlouhý řez ve vzdálenosti 6 mm od limbu rovnoběžně s limbem a okraje řezu byly posunuty o 3 mm posteriorně. Dva 8,0 vikrylové stehy byly použity jako trakční stehy v předních rozích spojivky. Čep byl vypreparován nad sklérou zezadu. Poté jsme provedli sklerální klapku 7x7. Přední okraj sklerální laloky byl vytvořen 8 mm od limbu, rovnoběžně s limbem očním nožem 30 stupňů. Byly provedeny dva další boční řezy o poloviční tloušťce, aby se vytvořila chlopeň ve tvaru písmene U, která má základnu rovnoběžnou s laterálním přímým svalem. Poté, počínaje od infero-anteriorního okraje, byla pomocí srpkovité čepele vypreparována hluboká sklerální chlopeň. Během pitvy by měl být pozorován černý choroidální reflex po celém povrchu lůžka laloku. Fibrinová zátka nesoucí sféroidní kmenové buňky byla umístěna přes cévnatku, která byla vidět pod tenkou bělmou. Byl překryt sklerální chlopní a chlopeň byla přišita do původní polohy od jejích okrajů 7,0 vikrylovým stehem. Čep a spojivka byly uzavřeny odděleně 8,0 vikrylovým stehem.