Células-tronco mesenquimais esferóides na retinite pigmentosa

Um ensaio clínico prospectivo foi conduzido em pacientes com PR no departamento de oftalmologia da Acibadem University, Medical School. O estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão do Departamento de Transplante de Células, Órgãos e Tecidos do Ministério da Saúde da Turquia. O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinque.

Avaliação do paciente Quinze pacientes com diagnóstico clínico e genético de FRy foram incluídos no estudo. Os pacientes foram submetidos a exame oftalmológico incluindo melhor acuidade visual corrigida (BCVA), pressão intra-ocular, exame do segmento anterior e exame de fundo de olho dilatado (com tropicamida tópica %1 e fenilefrina 2,5%). Cada olho foi submetido à OCT de domínio espectral com Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, EUA), autofluorescência de fundo e angiografia de fluoresceína de fundo (Heidelberg Engineering, Alemanha). Os parâmetros MD (desvio médio) e PSD (desvio padrão padrão) de estratégias de teste de campo visual (VF) 10-2 e 30-2 com um analisador de campo Humphrey modelo 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, EUA) foram obtidos. A função eletrofisiológica foi avaliada com avaliação mfERG (Monpack 3, Metrovision, França) de acordo com as diretrizes da Sociedade Internacional de Eletrofisiologia Clínica da Visão (ISCEV) [27]. BCVA foi convertido para o logaritmo do ângulo mínimo de resolução (logMAR) equivalente.

Os pacientes foram excluídos do estudo se tivessem 1) patologia ocular coexistente que pode afetar a acuidade visual, campo visual e morfologia da retina, como glaucoma, uveíte, cirurgia vitreorretiniana anterior, 2) catarata coexistente que pode afetar mfERG, campo visual e/ ou imagiologia ocular, 3) erro de refração que pode afetar medições superiores a +6,00D, inferior a -6,00D 4) doenças sistêmicas coexistentes que podem afetar a função visual, como diabetes, vasculite, doenças reumatológicas e uso crônico de imunossupressores, 5) injeção periocular de sangue rico em plaquetas e estimulação elétrica transcorneana nos últimos 6 meses e 6) cirurgia ocular prévia.

Teste eletrofisiológico Após 30 minutos de adaptação ao escuro e dilatação da pupila com a aplicação de uma gota de tropicamida 1% (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turquia), fenilefrina 2,5% (Mydfrin, Alcon) e cloridrato de proparacaína 0,5% (Alcaine, Alcon) , eletrodos de jato de ERG foram colocados. Eletrorretinografias multifocais foram registradas após a dilatação pupilar. A área retiniana estimulada foi subtendida em uma área de 60° x 55°; Foram usados ​​61 estimulantes hexagonais com estimulantes pretos alternados (5 cd/m2) e brancos (100 cd/m2). Os anéis concêntricos foram analisados ​​de acordo com os padrões da International Society for Clinical Electrophysiology of Vision.13 A amplitude e as latências dos componentes P1, N1 e N2 foram registradas para cada toque. As amplitudes médias do sinal (MSAs) da eletrorretinografia multifocal (mfERG) na mácula (central 0°-2°) e periférica (2°-5°,5°-10°, 10°-15° e >15° ) as mudanças na amplitude do sinal foram avaliadas separadamente.

Preparação de células-tronco esferoidais As células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical de primeira passagem foram obtidas do Labcell Cellular Laboratory Center, que fornece condições GMP (boas práticas de fabricação).

Produção de Esferóides A produção de esferóides continuou em condições GMP. Células-tronco mesenquimais derivadas do cordão umbilical de primeira passagem foram utilizadas na produção de esferoides. 100.000 células-tronco mesenquimais foram suspensas com 100 μl. Meio isento de soro (Meio MSC NutriStem® XF, Sartorius) contendo %1 de ciprofloxacina (Polipharma). Cada poço da placa de 96 poços de baixa fixação foi semeado com 100.000 células em 100 μl. médio. As células foram incubadas a 37°C por 48 horas. Ao final de 48 horas, todos os esferóides foram coletados com uma micropipeta e transferidos para solução de Ringer lactato (Osel/ Biofleks) contendo 1% de HSA (csl behring). Os esferóides foram lavados 3 vezes com solução de lactato de Ringer contendo HAS a 1% (csl behring). 50 esferóides foram produzidos para um paciente (50 esferóides contendo 5x106 células foram produzidos). 5 de 50 esferóides foram reservados para análise de controle de qualidade. As restantes 45 membranas esferóides foram incorporadas na matriz.

Produção de matriz e cultura de incorporação celular A mistura de matrizes contendo 225 µl de crioprecipitado + 22,5 µl de cálcio (Adeka) + 2,5 µl de transamina (Haver) foi adicionada a cada poço das placas de 96 poços. Quando a matriz se tornou semi-sólida, 45 esferóides foram incorporados no meio da matriz e incubados a 37 °C por 45 min. A matriz, que se solidificou completamente após 45 minutos, foi retirada com auxílio de bisturi, transferida para solução de Ringer lactato (Osel/Biofleks) contendo HAS 1% (csl behring) e encaminhada para a sala cirúrgica nesta solução (Figura 1).

Análise de Controle de Qualidade Hemocultura microbiológica, análise de fungos, endotoxinas e pureza (ciprofloxacina <0,1 µg/ml), eficiência (análise de diferenciação de adipócitos e cartilagem) Contagem/Viabilidade Celular e análise de citometria de fluxo (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) foram estudados a partir dos esferoides reservados para análises de controle de qualidade.

Técnica Cirúrgica Os pacientes foram operados sob anestesia geral. O quadrante inferotemporal foi escolhido como área cirúrgica. Seda 6.0 foi usada como sutura de ancoragem próximo ao limbo entre 4 e 5 horas. A conjuntiva e a espiga foram abertas como um corte de 6 mm de comprimento a 6 mm do limbo paralelo ao limbo e as bordas do corte foram avançadas 3 mm posteriormente. Duas suturas de vicryl 8.0 foram usadas como suturas de tração nos cantos anteriores da conjuntiva. A espiga foi dissecada sobre a esclera posteriormente. Em seguida, realizamos um retalho escleral 7x7. A margem anterior do retalho escleral foi criada a 8 mm do limbo, paralela ao limbo com bisturi oftálmico de 30 graus. Dois outros cortes laterais de meia espessura foram feitos para criar um retalho em forma de U que tem sua base paralela ao músculo reto lateral. A partir da borda ínfero-anterior, um retalho escleral profundo foi dissecado com lâmina crescente. Durante a dissecção, o reflexo negro da coróide deve ser observado em toda a superfície do leito do retalho. O tampão de fibrina contendo células-tronco esferóides foi colocado sobre a coróide que foi vista sob a esclera fina. Foi coberto pelo retalho escleral e o retalho foi suturado em sua posição original a partir de suas bordas com fio de vicryl 7.0. Tenon e conjuntiva foram fechados separadamente com uma sutura de vicryl 8.0.