Sfæroidale mesenkymale stamceller i Retinitis Pigmentosa

Et prospektivt klinisk forsøg blev udført med patienter med RP på oftalmologisk afdeling, Acibadem University, Medical School. Undersøgelsen blev godkendt af Review Board of Cell, Organ and Tissue Transplantation Department i det tyrkiske sundhedsministerium. Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

Patientevaluering Femten patienter med kliniske og genetiske diagnoser af RP blev inkluderet i undersøgelsen. Patienterne gennemgik oftalmisk undersøgelse, herunder bedst korrigeret synsstyrke (BCVA), intraokulært tryk, forreste segmentundersøgelse og dilateret fundusundersøgelse (med topisk tropicamid %1 og phenylephrin 2,5%). Hvert øje gennemgik spektral domæne OCT-scanning med Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), fundus autofluorescens og fundus fluorescein angiografi (Heidelberg Engineering, Tyskland). MD (middelafvigelse) og PSD (mønsterstandardafvigelse) parametre for 10-2 og 30-2 synsfelt (VF) teststrategier med en Humphrey Field Analyzer model 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA) blev opnået. Den elektrofysiologiske funktion blev vurderet med mfERG-evaluering (Monpack 3, Metrovision, Frankrig) i henhold til retningslinjerne fra International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. BCVA blev konverteret til logaritmen af ​​den minimale opløsningsvinkel (logMAR) ækvivalent.

Patienterne blev udelukket fra undersøgelsen, hvis de havde 1) sameksisterende okulær patologi, der kan påvirke synsstyrken, synsfeltet og nethindens morfologi såsom glaukom, uveitis, tidligere vitreoretinal kirurgi, 2) sameksisterende katarakt, der kan påvirke mfERG, synsfelt og/ eller okulær billeddannelse, 3) brydningsfejl, der kan påvirke målinger højere end +6.00D, lavere end -6.00D 4) sameksisterende systemiske sygdomme, der kan påvirke synsfunktionen såsom diabetes, vaskulitis, reumatologiske sygdomme og kronisk immunsuppressiv brug, 5) periokulær injektion af blodpladerigt blod og transcorneal elektrisk stimulation i de foregående 6 måneder og 6) tidligere øjenkirurgi.

Elektrofysiologisk testning Efter 30 minutters mørketilpasning og pupiludvidelse med påføring af en dråbe tropicamid 1% (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Tyrkiet), phenylephrin 2,5% (Mydfrin, Alcon) og proparacainhydrochlorid 0,5% (Alcaine, Alcon) , blev ERG-jetelektroder placeret. Multifokale elektroretinografier blev optaget efter pupiludvidelse. Det stimulerede retinale område blev dækket i et område på 60° x 55°; 61 sekskantstimulerende midler blev brugt med skiftevis sorte (5 cd/m2) og hvide (100 cd/m2) stimulanser. De koncentriske ringe blev analyseret i henhold til International Society for Clinical Electrophysiology of Vision standarder.13 Amplituden og latenserne for P1-, N1- og N2-komponenter blev registreret for hver ring. De gennemsnitlige signalamplituder (MSA'er) af multifokal elektroretinografi (mfERG) i macula (central 0°-2°) og den perifere (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° og >15° ) signalamplitudeændringer blev evalueret separat.

Præparation af sfæroide stamceller Første passage af navlestrengs-afledte mesenkymale stamceller blev opnået fra Labcell Cellular Laboratory Center, som giver GMP-betingelser (god fremstillingspraksis).

Sfæroidproduktion Sfæroidproduktionen fortsatte i GMP-tilstand. Første passage af navlestrengs-afledte mesenkymale stamceller blev brugt til fremstilling af sfæroider. 100.000 mesenkymale stamceller blev suspenderet med 100 μl. Serumfrit medium (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) indeholdende %1 ciprofloxacin (Polipharma). Hver brønd på pladen med 96 brønde med lav vedhæftning blev podet med 100.000 celler i 100 μl. medium. Cellerne blev inkuberet ved 37°C i 48 timer. Ved slutningen af ​​48 timer blev alle sfæroider opsamlet med en mikropipette og overført til Ringers lactatopløsning (Osel/Biofleks) indeholdende 1% HSA (csl behring). Sfæroider blev vasket 3 gange med Ringers lactatopløsning indeholdende 1% HAS (csl behring). 50 sfæroider blev produceret til én patient (50 sfæroider indeholdende 5x106 celler blev produceret). 5 af 50 sfæroider var reserveret til kvalitetskontrolanalyse. De resterende 45 sfæroide membraner blev indlejret i matrixen.

Matrixproduktion og celleindlejringskultur Matrixblanding indeholdende 225 µl kryopræcipitat + 22,5 µl calcium (Adeka) + 2,5 µl transamin (Haver) blev tilsat til hver brønd af 96-brønds pladerne. Da matrixen blev halvfast, blev 45 sfæroider indlejret i midten af ​​matrixen og inkuberet ved 37 °C i 45 min. Matrixen, som blev fuldstændig fast efter 45 minutter, blev fjernet ved hjælp af en skalpel, overført til Ringers lactatopløsning (Osel/Biofleks) indeholdende 1% HAS (csl behring), og overført til operationsstuen i denne opløsning (figur 1).

Kvalitetskontrol Analyse Mikrobiologisk blodkultur, svampe-, endotoksinanalyse og renhed (ciprofloxacin <0,1 µg/ml), effektivitet (analyse af adipocyt- og bruskdifferentiering) Celletal/levedygtighed og flowcytometrisk analyse (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) blev undersøgt fra de reserverede sfæroider til kvalitetskontrolanalyser.

Kirurgisk teknik Patienterne blev opereret under generel anæstesi. Den inferotemporale kvadrant blev valgt som operationsområde. 6.0 silke blev brugt som forankringssutur nær limbus mellem kl. 4 og 5. Bindehinde og tenon blev åbnet som 6 mm langt snit 6 mm fra limbus parallelt med limbus, og kanterne af snittet blev fremført 3 mm bagud. To 8,0 vicryl suturer blev brugt som træksuturer ved de forreste hjørner af bindehinden. Senen blev dissekeret over sclera posteriort. Derefter udførte vi en 7x7 scleral flap. Forreste margin af skleralklappen blev skabt 8 mm fra limbus, parallelt med limbus med en 30 graders oftalmisk kniv. To andre sidesnit i halv tykkelse blev lavet for at skabe en U-formet flap, der har sin base parallelt med den laterale rectusmuskel. Startende fra den infero-anteriore kant blev en dyb scleral flap dissekeret med et halvmåneblad. Under dissektionen bør sort koroidal refleks observeres rundt om overfladen af ​​flapbedet. Fibrinproppen, der bærer sfæroidale stamceller, blev placeret over årehinden, der blev set under den tynde sclera. Den blev dækket af sklerale flappen og flappen blev syet til sin oprindelige position fra dens kanter med en 7,0 vicryl sutur. Tenon og conjunctiva blev lukket separat med en 8,0 vicryl sutur.