Células madre mesenquimales esferoidales en la retinosis pigmentaria

Se realizó un ensayo clínico prospectivo en pacientes con RP en el departamento de oftalmología de la Facultad de Medicina de la Universidad Acibadem. El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión del Departamento de Trasplante de Células, Órganos y Tejidos del Ministerio de Salud de Turquía. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki.

Evaluación de los pacientes Se incluyeron en el estudio quince pacientes con diagnósticos clínicos y genéticos de RP. Los pacientes se sometieron a un examen oftalmológico que incluyó la mejor agudeza visual corregida (MAVC), presión intraocular, examen del segmento anterior y examen del fondo de ojo dilatado (con tropicamida tópica %1 y fenilefrina al 2,5%). Cada ojo se sometió a una exploración OCT de dominio espectral con Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, EE. UU.), autofluorescencia de fondo de ojo y angiografía de fondo de ojo con fluoresceína (Heidelberg Engineering, Alemania). Se obtuvieron los parámetros MD (desviación media) y PSD (desviación estándar del patrón) de las estrategias de prueba de campo visual (VF) 10-2 y 30-2 con un analizador de campo Humphrey modelo 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, EE. UU.). La función electrofisiológica se evaluó con la evaluación mfERG (Monpack 3, Metrovision, Francia) de acuerdo con las pautas de la Sociedad Internacional de Electrofisiología Clínica de la Visión (ISCEV) [27]. BCVA se convirtió al logaritmo del ángulo mínimo de resolución (logMAR) equivalente.

Los pacientes fueron excluidos del estudio si tenían 1) patología ocular coexistente que pudiera afectar la agudeza visual, el campo visual y la morfología retiniana como glaucoma, uveítis, cirugía vitreorretiniana previa, 2) catarata coexistente que pudiera afectar el ERGmf, el campo visual y/ o imágenes oculares, 3) error de refracción que puede afectar mediciones superiores a +6.00D, inferiores a -6.00D 4) enfermedades sistémicas coexistentes que pueden afectar la función visual como diabetes, vasculitis, enfermedades reumatológicas y uso crónico de inmunosupresores, 5) inyección periocular de sangre rica en plaquetas y estimulación eléctrica transcorneal en los 6 meses previos y 6) cirugía ocular previa.

Pruebas electrofisiológicas Después de 30 minutos de adaptación a la oscuridad y dilatación de la pupila con la aplicación de una gota de tropicamida al 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turquía), fenilefrina al 2,5 % (Mydfrin, Alcon) y clorhidrato de proparacaína al 0,5 % (Alcaine, Alcon) , se colocaron electrodos jet ERG. Se registraron electrorretinografías multifocales tras dilatación pupilar. El área retiniana estimulada se subtendió en un área de 60° x 55°; Se usaron 61 estimulantes hexagonales alternando estimulantes negros (5 cd/m2) y blancos (100 cd/m2). Los anillos concéntricos se analizaron según los estándares de la Sociedad Internacional de Electrofisiología Clínica de la Visión13. La amplitud y las latencias de los componentes P1, N1 y N2 se registraron para cada anillo. Las amplitudes medias de la señal (MSA) de la electrorretinografía multifocal (mfERG) en la mácula (central 0°-2°) y periférica (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° y >15° ) los cambios de amplitud de la señal se evaluaron por separado.

Preparación de células madre esferoidales Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical de primer paso se obtuvieron del Centro de laboratorio celular Labcell, que proporciona condiciones GMP (buenas prácticas de fabricación).

Producción de esferoides La producción de esferoides continuó en condiciones GMP. Se utilizaron células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical de primer pase en la producción de esferoides. Se suspendieron 100.000 células madre mesenquimales con 100 μl. Medio sin suero (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) que contiene %1 de ciprofloxacina (Polipharma). Cada pocillo de la placa de 96 pocillos de baja adherencia se sembró con 100.000 células en 100 μl. medio. Las células se incubaron a 37 °C durante 48 horas. Al cabo de 48 horas, todos los esferoides se recogieron con una micropipeta y se transfirieron a solución de lactato de Ringer (Osel/Biofleks) que contenía HSA al 1% (csl behring). Los esferoides se lavaron 3 veces con solución de lactato de Ringer que contenía HAS al 1% (csl behring). Se produjeron 50 esferoides para un paciente (se produjeron 50 esferoides que contenían 5x106 células). 5 de 50 esferoides se reservaron para análisis de control de calidad. Las 45 membranas esferoides restantes se incluyeron en la matriz.

Producción de matriz y cultivo de inclusión celular Se añadió una mezcla de matriz que contenía 225 µl de crioprecipitado + 22,5 µl de calcio (Adeka) + 2,5 µl de transamina (Haver) a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Cuando la matriz se volvió semisólida, se incrustaron 45 esferoides en el medio de la matriz y se incubaron a 37 °C durante 45 min. La matriz, que se volvió completamente sólida después de 45 minutos, se retiró con la ayuda de un bisturí, se transfirió a solución de lactato de Ringer (Osel/ Biofleks) que contenía HAS al 1% (csl behring), y se llevó a quirófano en esta solución (Figura 1).

Análisis de control de calidad Hemocultivo microbiológico, hongos, análisis de endotoxinas y pureza (ciprofloxacina <0,1 µg/ml), eficiencia (análisis de diferenciación de adipocitos y cartílagos) Recuento celular/viabilidad y análisis de citometría de flujo (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) de los esferoides reservados para análisis de control de calidad.

Técnica quirúrgica Los pacientes fueron intervenidos bajo anestesia general. El cuadrante inferotemporal fue elegido como área quirúrgica. Se usó seda 6.0 como sutura de anclaje cerca del limbo entre las 4 y las 5 en punto. La conjuntiva y la espiga se abrieron como un corte de 6 mm de largo a 6 mm del limbo paralelo al limbo y los bordes del corte se avanzaron 3 mm hacia atrás. Se utilizaron dos suturas de vicryl 8.0 como suturas de tracción en las esquinas anteriores de la conjuntiva. La espiga se diseccionó sobre la esclerótica posteriormente. Luego realizamos un colgajo escleral de 7x7. El margen anterior del colgajo escleral se creó a 8 mm del limbo, paralelo al limbo con bisturí oftálmico de 30 grados. Se realizaron otros dos cortes laterales de medio espesor para crear un colgajo en forma de U que tiene su base paralela al músculo recto lateral. Luego, partiendo del borde inferoanterior, se disecó un colgajo escleral profundo con una cuchilla en media luna. Durante la disección debe observarse un reflejo coroideo negro en toda la superficie del lecho del colgajo. El tapón de fibrina que contenía células madre esferoidales se colocó sobre la coroides que se veía debajo de la delgada esclerótica. Se cubrió con el colgajo escleral y se suturó el colgajo a su posición original desde sus bordes con una sutura de vicryl 7.0. La espiga y la conjuntiva se cerraron por separado con una sutura de vicryl 8.0.