Sfæroidale mesenkymale stamceller i Retinitis Pigmentosa

En prospektiv klinisk studie ble utført med pasienter med RP ved avdelingen for oftalmologi, Acibadem University, Medical School. Studien ble godkjent av Review Board of Cell, Organ and Tissue Transplantation Department ved det tyrkiske helsedepartementet. Studien ble utført i samsvar med Helsinki-erklæringen.

Pasientvurdering Femten pasienter med kliniske og genetiske diagnoser av RP ble inkludert i studien. Pasientene gjennomgikk oftalmisk undersøkelse inkludert best korrigert synsskarphet (BCVA), intraokulært trykk, fremre segmentundersøkelse og utvidet fundusundersøkelse (med topisk tropicamid %1 og fenylefrin 2,5 %). Hvert øye gjennomgikk spektraldomene OCT-skanning med Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), fundus autofluorescens og fundus fluorescein angiografi (Heidelberg Engineering, Tyskland). MD (gjennomsnittlig avvik) og PSD (mønsterstandardavvik) parametere for 10-2 og 30-2 synsfelt (VF) teststrategier med en Humphrey Field Analyzer modell 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA) ble oppnådd. Den elektrofysiologiske funksjonen ble vurdert med mfERG-evaluering (Monpack 3, Metrovision, Frankrike) i henhold til retningslinjer fra International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. BCVA ble konvertert til logaritmen for den minimale oppløsningsvinkelen (logMAR) ekvivalent.

Pasientene ble ekskludert fra studien, hvis de hadde 1) sameksisterende okulær patologi som kan påvirke synsskarphet, synsfelt og retinal morfologi som glaukom, uveitt, tidligere vitreoretinal kirurgi, 2) sameksisterende katarakt som kan påvirke mfERG, synsfelt og/ eller okulær avbildning, 3) brytningsfeil som kan påvirke målinger høyere enn +6.00D, lavere enn -6.00D 4) sameksisterende systemiske sykdommer som kan påvirke visuell funksjon som diabetes, vaskulitt, revmatologiske sykdommer og kronisk immunsuppressiv bruk, 5) periokulær injeksjon av blodplaterikt blod og transcorneal elektrisk stimulering de siste 6 måneder og 6) tidligere okulær kirurgi.

Elektrofysiologisk testing Etter 30 minutter med mørketilpasning og pupillutvidelse med påføring av en dråpe tropicamid 1 % (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Tyrkia), fenylefrin 2,5 % (Mydfrin, Alcon) og proparakainhydroklorid 0,5 % (Alcaine, Alcon) , ble ERG-jetelektroder plassert. Multifokale elektroretinografier ble registrert etter pupillutvidelse. Det stimulerte netthinneområdet ble dekket i et område på 60° x 55°; 61 sekskantstimulerende midler ble brukt med vekslende svarte (5 cd/m2) og hvite (100 cd/m2) stimulanter. De konsentriske ringene ble analysert i henhold til International Society for Clinical Electrophysiology of Vision standarder.13 Amplituden og latensene til P1-, N1- og N2-komponentene ble registrert for hver ring. De gjennomsnittlige signalamplitudene (MSA) for multifokal elektroretinografi (mfERG) i guleflekken (sentral 0°-2°) og den perifere (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° og >15° ) signalamplitudeendringer ble evaluert separat.

Forberedelse av sfæroide stamceller Første passasje navlestrengsavledet mesenkymal stamcelle ble oppnådd fra Labcell Cellular Laboratory Center som gir GMP-betingelser (god produksjonspraksis).

Sfæroidproduksjon Sfæroidproduksjonen fortsatte i GMP-tilstand. Mesenkymale stamceller avledet av navlestreng fra første passasje ble brukt i produksjonen av sfæroider. 100 000 mesenkymale stamceller ble suspendert med 100 μl. Serumfritt medium (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) som inneholder %1 ciprofloksacin (Polipharma). Hver brønn på 96-brønns-platen med lavt vedlegg ble sådd med 100 000 celler i 100 μl. medium. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 48 timer. Ved slutten av 48 timer ble alle sfæroider samlet med en mikropipette og overført til Ringers laktatløsning (Osel/Biofleks) inneholdende 1 % HSA (csl behring). Sfæroider ble vasket 3 ganger med Ringers laktatløsning inneholdende 1 % HAS (csl behring). 50 sfæroider ble produsert for én pasient (50 sfæroider som inneholdt 5x106 celler ble produsert). 5 av 50 sfæroider var reservert for kvalitetskontrollanalyse. De resterende 45 sfæroidmembranene ble innebygd i matrisen.

Matriseproduksjon og celleinnleiringskultur Matriseblanding inneholdende 225 µl kryopresipitat + 22,5 µl kalsium (Adeka) + 2,5 µl transamin (Haver) ble tilsatt til hver brønn av 96-brønnsplatene. Når matrisen ble halvfast, ble 45 sfæroider innebygd i midten av matrisen og inkubert ved 37 ° C i 45 minutter. Matrisen, som ble helt fast etter 45 minutter, ble fjernet ved hjelp av en skalpell, overført til Ringers laktatløsning (Osel/ Biofleks) inneholdende 1 % HAS (csl behring), og overført til operasjonssalen i denne løsningen (figur 1).

Kvalitetskontrollanalyse Mikrobiologisk blodkultur, sopp-, endotoksinanalyse og renhet (ciprofloksacin <0,1 µg/ml), effektivitet (analyse av adipocytt- og bruskdifferensiering) Celletall/Viabilitet og flowcytometrisk analyse (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) ble studert fra de reserverte sfæroidene for kvalitetskontrollanalyser.

Kirurgisk teknikk Pasienter ble operert under generell anestesi. Den inferotemporale kvadranten ble valgt som operasjonsområde. 6.0 silke ble brukt som forankringssutur nær limbus mellom klokken 4 og 5. Konjunktiva og tenon ble åpnet som 6 mm langt kutt ved 6 mm fra limbus parallelt med limbus og kantene av kuttet ble fremført 3 mm bakover. To 8,0 vicryl-suturer ble brukt som trekksuturer ved de fremre hjørnene av konjunktiva. Tenonen ble dissekert over sclera posteriort. Deretter utførte vi en 7x7 scleral klaff. Fremre margin av skleralklaffen ble laget 8 mm fra limbus, parallelt med limbus med 30 grader oftalmisk kniv. To andre sidekutt i halv tykkelse ble gjort for å lage en U-formet klaff som har sin base parallelt med den laterale rektusmuskelen. Deretter startet fra infero-fremre kant, en dyp skleral flik ble dissekert med et halvmåneblad. Under disseksjonen bør svart koroidal refleks observeres rundt hele overflaten av flapsengen. Fibrinpluggen med sfæroidale stamceller ble plassert over årehinnen som ble sett under den tynne sclera. Den ble dekket av skleralklaffen og klaffen ble suturert til sin opprinnelige posisjon fra kantene med en 7,0 vicryl sutur. Tenon og conjunctiva ble lukket separat med en 8,0 vicryl sutur.