Cellule staminali mesenchimali sferoidali nella retinite pigmentosa

Uno studio clinico prospettico è stato condotto su pazienti con RP presso il dipartimento di oftalmologia, Acibadem University, Medical school. Lo studio è stato approvato dal Review Board of Cell, Organ and Tissue Transplantation Department del Ministero della Salute turco. Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.

Valutazione del paziente Sono stati inclusi nello studio quindici pazienti con diagnosi clinica e genetica di RP. I pazienti sono stati sottoposti a esame oftalmologico inclusa la migliore acuità visiva corretta (BCVA), pressione intraoculare, esame del segmento anteriore ed esame del fondo dilatato (con tropicamide topica %1 e fenilefrina 2,5%). Ogni occhio è stato sottoposto a scansione OCT del dominio spettrale con Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublino, CA, USA), autofluorescenza del fondo e angiografia con fluoresceina del fondo (Heidelberg Engineering, Germania). Sono stati ottenuti i parametri MD (deviazione media) e PSD (deviazione standard del modello) delle strategie di test del campo visivo (VF) 10-2 e 30-2 con un Humphrey Field Analyzer modello 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublino, CA, USA). La funzione elettrofisiologica è stata valutata con la valutazione mfERG (Monpack 3, Metrovision, Francia) secondo le linee guida della International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. BCVA è stato convertito nel logaritmo dell'equivalente dell'angolo minimo di risoluzione (logMAR).

I pazienti sono stati esclusi dallo studio, se presentavano 1) patologia oculare coesistente che può influenzare l'acuità visiva, il campo visivo e la morfologia retinica come glaucoma, uveite, precedente chirurgia vitreoretinica, 2) cataratta coesistente che può influenzare mfERG, campo visivo e/ o imaging oculare, 3) errore di rifrazione che può influenzare misurazioni superiori a +6.00D, inferiori a -6.00D 4) malattie sistemiche coesistenti che possono influenzare la funzione visiva come diabete, vasculite, malattie reumatologiche e uso cronico di immunosoppressori, 5) iniezione perioculare di sangue ricco di piastrine e stimolazione elettrica transcorneale nei 6 mesi precedenti e 6) precedente intervento chirurgico oculare.

Test elettrofisiologici Dopo 30 minuti di adattamento al buio e dilatazione della pupilla con l'applicazione di una goccia di tropicamide 1% (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turkey), fenilefrina 2,5% (Mydfrin, Alcon) e proparacaina cloridrato 0,5% (Alcaine, Alcon) , sono stati posizionati gli elettrodi a getto ERG. Elettroretinografie multifocali sono state registrate dopo la dilatazione della pupilla. L'area retinica stimolata era sottesa in un'area di 60° x 55°; Sono stati usati 61 stimolanti esagonali alternando stimolanti neri (5 cd/m2) e bianchi (100 cd/m2). Gli anelli concentrici sono stati analizzati secondo gli standard dell'International Society for Clinical Electrophysiology of Vision.13 L'ampiezza e le latenze dei componenti P1, N1 e N2 sono state registrate per ogni anello. Le ampiezze medie del segnale (MSA) dell'elettroretinografia multifocale (mfERG) nella macula (centrale 0°-2°) e periferica (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° e >15° ) le variazioni di ampiezza del segnale sono state valutate separatamente.

Preparazione delle cellule staminali sferoidali La cellula staminale mesenchimale derivata dal cordone ombelicale di primo passaggio è stata ottenuta dal Labcell Cellular Laboratory Center che fornisce condizioni GMP (buone pratiche di fabbricazione).

Produzione di sferoidi La produzione di sferoidi è continuata in condizioni GMP. Le cellule staminali mesenchimali derivate dal cordone ombelicale di primo passaggio sono state utilizzate nella produzione di sferoidi. 100.000 cellule staminali mesenchimali sono state sospese con 100 μl. Terreno privo di siero (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) contenente %1 ciprofloxacina (Polipharma). Ogni pozzetto della piastra a 96 pozzetti a basso attacco è stato seminato con 100.000 cellule in 100 μl. medio. Le cellule sono state incubate a 37°C per 48 ore. Al termine delle 48 ore, tutti gli sferoidi sono stati raccolti con una micropipetta e trasferiti nella soluzione di lattato di Ringer (Osel/Biofleks) contenente l'1% di HSA (csl behring). Gli sferoidi sono stati lavati 3 volte con la soluzione di lattato di Ringer contenente HAS all'1% (csl behring). Sono stati prodotti 50 sferoidi per un paziente (sono stati prodotti 50 sferoidi contenenti 5x106 cellule). 5 sferoidi su 50 erano riservati per l'analisi del controllo di qualità. Le restanti 45 membrane sferoidali sono state incorporate nella matrice.

Produzione di matrici e coltura di inclusione di cellule Una miscela di matrici contenente 225 ul di crioprecipitato + 22,5 ul di calcio (Adeka) + 2,5 ul di transamina (Haver) è stata aggiunta a ciascun pozzetto delle piastre da 96 pozzetti. Quando la matrice è diventata semisolida, 45 sferoidi sono stati incorporati al centro della matrice e incubati a 37 °C per 45 min. La matrice, che è diventata completamente solida dopo 45 minuti, è stata rimossa con l'ausilio di un bisturi, trasferita nella soluzione di lattato di Ringer (Osel/Biofleks) contenente l'1% di HAS (csl behring) e trasferita in sala operatoria in questa soluzione (Figura 1).

Analisi controllo qualità Emocoltura microbiologica, analisi fungine, analisi e purezza delle endotossine (ciprofloxacina <0,1 µg/ml), efficienza (analisi di differenziazione degli adipociti e della cartilagine) Conta cellulare/Vitabilità e analisi citometrica a flusso (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) sono stati studiati dagli sferoidi riservati per analisi di controllo qualità.

Tecnica chirurgica I pazienti sono stati sottoposti a intervento chirurgico in anestesia generale. Come area chirurgica è stato scelto il quadrante inferotemporale. La seta 6.0 è stata utilizzata come sutura di ancoraggio vicino al limbus tra le 4 e le 5. La congiuntiva e il tenone sono stati aperti come un taglio lungo 6 mm a 6 mm dal limbus parallelo al limbus e i bordi del taglio sono stati avanzati di 3 mm posteriormente. Due suture in Vicryl 8.0 sono state utilizzate come suture di trazione agli angoli anteriori della congiuntiva. Il tenone è stato sezionato posteriormente sopra la sclera. Quindi abbiamo eseguito un lembo sclerale 7x7. Il margine anteriore del lembo sclerale è stato creato a 8 mm dal limbus, parallelamente al limbus con bisturi oftalmico a 30 gradi. Sono stati eseguiti altri due tagli laterali di mezzo spessore per creare un lembo a forma di U che ha la base parallela al muscolo retto laterale. Quindi, partendo dal bordo infero-anteriore, è stato sezionato con una lama a mezzaluna un lembo sclerale profondo. Durante la dissezione si dovrebbe osservare il riflesso coroidale nero su tutta la superficie del letto del lembo. Il tappo di fibrina che trasportava cellule staminali sferoidali è stato posizionato sopra la coroide visibile sotto la sottile sclera. Era coperto dal lembo sclerale e il lembo è stato suturato nella sua posizione originale dai bordi con una sutura in Vicryl 7.0. Il tenone e la congiuntiva sono stati chiusi separatamente con una sutura in vicryl 8.0.