색소성 망막염에서 회전타원체 중간엽 줄기세포

Acibadem University, Medical school 안과에서 RP 환자를 대상으로 전향적 임상 시험을 실시했습니다. 이 연구는 터키 보건부의 세포, 장기 및 조직 이식 부서 심사위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구는 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다.

환자 평가 RP의 임상적 및 유전적 진단을 받은 15명의 환자가 연구에 포함되었습니다. 환자들은 최고교정시력(BCVA), 안압, 전안부 검사 및 확장된 안저 검사(국소 트로피카미드 %1 및 페닐에프린 2.5% 사용)를 포함한 안과 검사를 받았습니다. 각 눈은 Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex(Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA), 안저 자가형광 및 안저 형광 혈관 조영술(독일 하이델베르그 엔지니어링)을 사용하여 스펙트럼 도메인 OCT 스캐닝을 거쳤습니다. Humphrey Field Analyzer 모델 750I(Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, USA)를 사용한 10-2 및 30-2 시야(VF) 테스트 전략의 MD(평균 편차) 및 PSD(패턴 표준 편차) 매개변수를 얻었습니다. 전기생리학적 기능은 International Society for Clinical Electrophysiology of Vision(ISCEV) 가이드라인에 따라 mfERG 평가(Monpack 3, Metrovision, France)로 평가하였다[27]. BCVA는 최소 해상도 각도(logMAR) 등가물의 로그로 변환되었습니다.

환자가 1) 녹내장, 포도막염, 이전 유리체망막 수술과 같은 시력, 시야 및 망막 형태에 영향을 미칠 수 있는 공존하는 안구 병리, 2) mfERG, 시야 및/또는 3) +6.00D 이상, -6.00D 이하 측정에 영향을 줄 수 있는 굴절 이상 4) 당뇨병, 혈관염, 류마티스 질환 및 만성 면역억제제 사용 등 시각 기능에 영향을 줄 수 있는 전신 질환 동반, 5) 안구주위 주사 이전 6개월 및 6) 이전 안과 수술에서 혈소판이 풍부한 혈액 및 경피적 전기 자극.

전기생리학적 검사 30분간 암순응 및 동공 확장 후 tropicamide 1%(Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turkey), phenylephrine 2.5%(Mydfrin, Alcon), proparacaine hydrochloride 0.5%(Alcaine, Alcon) , ERG 제트 전극을 배치하였다. 동공 확장 후 다초점 전기망막조영술을 기록했습니다. 자극된 망막 영역은 60° x 55°의 영역에 대응되었습니다. 61개의 육각형 자극제를 검은색(5cd/m2) 및 흰색(100cd/m2) 자극제를 번갈아 사용했습니다. 동심 고리는 International Society for Clinical Electrophysiology of Vision 표준에 따라 분석되었습니다.13 P1, N1 및 N2 구성 요소의 진폭 및 대기 시간은 모든 링에 대해 기록되었습니다. 황반(중앙 0°-2°) 및 주변부(2°-5°, 5°-10°, 10°-15° 및 >15°)에서의 다초점 망막전도검사(mfERG)의 평균 신호 진폭(MSA) ) 신호 진폭 변화는 별도로 평가되었습니다.

회전타원체 줄기세포 준비 1차 계대 탯줄 유래 중간엽 줄기세포는 GMP(Good Manufacturing Practices) 조건을 제공하는 Labcell Cellular Laboratory Center에서 입수했습니다.

회전 타원체 생산 GMP 조건에서 회전 타원체 생산을 계속했습니다. 1차 계대 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 스페로이드 생산에 사용했습니다. 100,000 중간엽 줄기 세포를 100 μl로 부유시켰다. %1 시프로플록사신(Polipharma)을 함유하는 무혈청 배지(MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius). 저부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100㎕에 100,000개의 세포를 시딩하였다. 중간. 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후, 모든 회전 타원체를 마이크로피펫으로 수집하고 1% HSA(csl behring)가 함유된 Ringer's lactate 용액(Osel/Biofleks)으로 옮겼습니다. 스페로이드는 1% HAS(csl behring)를 포함하는 Ringer's lactate 용액으로 3회 세척되었습니다. 한 환자에 대해 50개의 스페로이드가 생성되었습니다(5x106 세포를 포함하는 50개의 스페로이드가 생성됨). 50개의 스페로이드 중 5개는 품질 관리 분석을 위해 예약되었습니다. 나머지 45개의 회전 타원체 막을 매트릭스에 내장했습니다.

매트릭스 생산 및 세포 포매 배양 225μl 동결 침전물 + 22.5μl 칼슘(Adeka) + 2.5μl 트랜스아민(Haver)을 함유하는 매트릭스 혼합물을 96웰 플레이트의 각 웰에 첨가했습니다. 매트릭스가 반고체가 되면 45개의 스페로이드가 매트릭스 중앙에 삽입되고 37°C에서 45분 동안 배양됩니다. 45분 후 완전히 고형화된 매트릭스를 메스로 제거하고 1% HAS(csl behring)가 함유된 Ringer's lactate solution(Osel/Biofleks)에 옮긴 후 이 용액에 담가 수술실로 옮겼다(Figure 1). 1).

품질 관리 분석 미생물학적 혈액 배양, 진균, 내독소 분석 및 순도(ciprofloxacin <0,1 µg/ml), 효율(지방세포 및 연골 분화 분석) 세포 수/생존율 및 유세포 분석(CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70)을 품질 관리 분석을 위해 예약된 회전 타원체에서 연구했습니다.

수술 기법 환자는 전신 마취하에 수술을 받았습니다. Inferotemporal 사분면은 수술 영역으로 선택되었습니다. 6.0 실크는 4시에서 5시 사이 윤부 근처의 고정 봉합사로 사용되었습니다. 결막과 장부는 윤부에 평행한 윤부에서 6mm 지점에서 6mm 길이로 절개하고 절단부의 가장자리는 후방으로 3mm 전진시켰다. 8.0 비크릴 봉합사 2개를 결막 전방 모서리 견인 봉합사로 사용하였다. 장부(tenon)는 공막(sclera) 후방에서 해부되었다. 그런 다음 7x7 공막 피판을 수행했습니다. 공막 피판의 전방 가장자리는 30도 안과 칼로 윤부에 평행하게 윤부로부터 8mm 지점에 생성되었습니다. 2개의 다른 절반 두께의 측면 절단은 외직근과 평행한 베이스를 갖는 U자형 피판을 생성하기 위해 만들어졌습니다. 그런 다음 아래쪽 앞쪽 가장자리에서 시작하여 초승달 모양의 칼날로 깊은 공막 플랩을 해부했습니다. 해부 중에 흑색 맥락막 반사가 플랩 베드 표면 전체에서 관찰되어야 합니다. 구상 줄기 세포를 운반하는 피브린 플러그를 얇은 공막 아래에 보이는 맥락막 위에 위치시켰다. 공막피판으로 덮고 피판을 7.0 비크릴 봉합사로 가장자리에서 원래 위치로 봉합했습니다. 장부와 결막은 8.0 비크릴 봉합사로 별도로 봉합되었습니다.