Sferoïdale mesenchymale stamcellen in Retinitis Pigmentosa

Een prospectieve klinische studie werd uitgevoerd bij patiënten met RP op de afdeling oogheelkunde, Acibadem University, Medical School. De studie werd goedgekeurd door de Review Board of Cell, Organ and Tissue Transplantation Department van het Turkse ministerie van Volksgezondheid. De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.

Patiëntevaluatie Vijftien patiënten met klinische en genetische diagnose van RP werden in de studie opgenomen. Patiënten ondergingen oogheelkundig onderzoek, waaronder best gecorrigeerde gezichtsscherpte (BCVA), intraoculaire druk, onderzoek van het voorste segment en onderzoek van de verwijde fundus (met topisch tropicamide %1 en fenylefrine 2,5%). Elk oog onderging OCT-scanning in het spectrale domein met Cirrus 5000 HD-OCT Angioplex (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, VS), fundus autofluorescentie en fundus fluoresceïne-angiografie (Heidelberg Engineering, Duitsland). MD (gemiddelde afwijking) en PSD (patroon standaarddeviatie) parameters van 10-2 en 30-2 gezichtsveld (VF) teststrategieën met een Humphrey Field Analyzer model 750I (Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA, VS) werden verkregen. De elektrofysiologische functie werd beoordeeld met mfERG-evaluatie (Monpack 3, Metrovision, Frankrijk) volgens de richtlijnen van de International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV) [27]. BCVA werd geconverteerd naar de logaritme van het equivalent van de minimale resolutiehoek (logMAR).

De patiënten werden uitgesloten van het onderzoek als ze 1) naast elkaar bestaande oculaire pathologie hadden die de gezichtsscherpte, het gezichtsveld en de morfologie van het netvlies kunnen beïnvloeden, zoals glaucoom, uveïtis, eerdere vitreoretinale chirurgie, 2) naast elkaar bestaande cataract die van invloed kan zijn op mfERG, gezichtsveld en/of of oculaire beeldvorming, 3) brekingsfout die van invloed kan zijn op metingen hoger dan +6.00D, lager dan -6.00D 4) naast elkaar bestaande systemische ziekten die de visuele functie kunnen beïnvloeden, zoals diabetes, vasculitis, reumatologische aandoeningen en chronisch immunosuppressief gebruik, 5) perioculaire injectie van bloedplaatjesrijk bloed en transcorneale elektrische stimulatie in de afgelopen 6 maanden en 6) eerdere oogchirurgie.

Elektrofysiologisch onderzoek Na 30 minuten aanpassing aan het donker en pupilverwijding met het aanbrengen van één druppel tropicamide 1% (Tropamid, Bilim ˙Ilaç, Turkije), fenylefrine 2,5% (Mydfrin, Alcon) en proparacaïnehydrochloride 0,5% (Alcaine, Alcon) , ERG-straalelektroden werden geplaatst. Multifocale electroretinografieën werden opgenomen na pupilverwijding. Het gestimuleerde netvliesgebied was ingesloten in een gebied van 60° x 55°; Er werden 61 zeshoekige stimulerende middelen gebruikt met afwisselend zwarte (5 cd/m2) en witte (100 cd/m2) stimulerende middelen. De concentrische ringen werden geanalyseerd volgens de normen van de International Society for Clinical Electrophysiology of Vision.13 De amplitude en latenties van P1-, N1- en N2-componenten werden voor elke ring geregistreerd. De gemiddelde signaalamplitudes (MSA's) van multifocale elektroretinografie (mfERG) in de macula (centraal 0°-2°) en de perifere (2°-5°, 5°-10°, 10°-15° en >15° ) signaalamplitudeveranderingen werden afzonderlijk geëvalueerd.

Preparatie van sferoïdale stamcellen De eerste passage van mesenchymale stamcellen afkomstig uit de navelstreng werd verkregen van het Labcell Cellular Laboratory Center, dat GMP-omstandigheden (goede productiepraktijken) biedt.

Productie van sferoïden De productie van sferoïden ging door in GMP-conditie. Uit de navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen van de eerste passage werden gebruikt bij de productie van sferoïden. 100.000 mesenchymale stamcellen werden gesuspendeerd met 100 µl. Serumvrij medium (MSC NutriStem® XF Medium, Sartorius) met %1 ciprofloxacine (Polipharma). Elk putje van de plaat met 96 putjes met lage bevestiging werd geënt met 100.000 cellen in 100 μl. medium. De cellen werden 48 uur bij 37°C geïncubeerd. Na 48 uur werden alle sferoïden verzameld met een micropipet en overgebracht in Ringer's lactaatoplossing (Osel/Biofleks) met 1% HSA (csl behring). Sferoïden werden 3 keer gewassen met Ringer's lactaatoplossing die 1% HAS (csl behring) bevatte. Er werden 50 sferoïden geproduceerd voor één patiënt (50 sferoïden met 5x106 cellen werden geproduceerd). 5 van de 50 sferoïden waren gereserveerd voor kwaliteitscontroleanalyse. De resterende 45 bolvormige membranen werden ingebed in de matrix.

Matrixproductie en celinbedding Kweek Een matrixmengsel dat 225 µl cryoprecipitaat + 22,5 µl calcium (Adeka) + 2,5 µl transamine (Haver) bevatte, werd aan elk putje van de platen met 96 putjes toegevoegd. Toen de matrix halfvast werd, werden 45 sferoïden ingebed in het midden van de matrix en gedurende 45 minuten bij 37 ° C geïncubeerd. De matrix, die na 45 minuten volledig vast werd, werd verwijderd met behulp van een scalpel, overgebracht in Ringer's lactaatoplossing (Osel/Biofleks) met 1% HAS (csl behring) en in deze oplossing overgebracht naar de operatiekamer (Figuur 1).

Kwaliteitscontrole Analyse Microbiologische bloedkweek, schimmel-, endotoxine-analyse en zuiverheid (ciprofloxacine <0,1 µg/ml), efficiëntie (adipocyten- en kraakbeendifferentiatieanalyse) Celtelling/levensvatbaarheid en flowcytometrische analyse (CD34 <%2, CD45 <%4 , CD90 >%80, HLA-DR <%4, CD105 >%60, CD73 >%70) werden bestudeerd van de gereserveerde sferoïden voor kwaliteitscontroleanalyses.

Chirurgische techniek Patiënten werden geopereerd onder algehele narcose. Het inferotemporale kwadrant werd gekozen als operatiegebied. 6.0 zijde werd gebruikt als verankeringshechting nabij de limbus tussen 4 en 5 uur. Conjunctiva en pen werden geopend als een snede van 6 mm lang op 6 mm van de limbus evenwijdig aan de limbus en de randen van de snede werden 3 mm naar achteren geschoven. Twee 8.0 vicryl-hechtdraden werden gebruikt als trekhechtingen aan de voorste hoeken van het bindvlies. De pen werd achterwaarts over de sclera opengesneden. Daarna voerden we een 7x7 sclerale flap uit. De voorste rand van de sclerale flap werd gemaakt op 8 mm van de limbus, evenwijdig aan de limbus met een oogheelkundig mes van 30 graden. Er werden nog twee andere zijsneden van halve dikte gemaakt om een ​​U-vormige flap te creëren waarvan de basis evenwijdig is aan de laterale rectusspier. Vervolgens werd vanaf de infero-anterieure rand een diepe sclerale flap ontleed met een halvemaanvormig mes. Tijdens de dissectie moet een zwarte choroïdale reflex worden waargenomen rondom het oppervlak van het flapbed. De fibrineplug met sferoïdale stamcellen werd over de choroidea geplaatst die onder de dunne sclera te zien was. Het werd bedekt door de sclerale flap en de flap werd vanaf de randen in zijn oorspronkelijke positie gehecht met een 7.0 vicryl-hechtdraad. Tenon en conjunctiva werden afzonderlijk gesloten met een 8.0 vicryl-hechtdraad.