急性虚血性脳卒中：実験室から患者のベッドまで (STROKELABED)

このプロジェクトの目的は、血液脳関門の破壊に関連する循環バイオマーカーと、脳浮腫の発症、出血性変化、および最新の神経画像技術を用いて調査された虚血領域の拡大との相関関係を評価し、再灌流障害の予測因子を特定することです。血行再建療法を受けている患者。

臨床研究と並行して、研究者は、神経変性と血管透過性の変化との相関関係に関する機構的側面を調査します。 この目的のために、研究者は虚血性脳卒中の新規マウスモデルで高度な顕微鏡技術と重要な蛍光マーキングの組み合わせを使用します。

- 臨床設定: これは、2015 年 10 月 1 日から 2020 年 5 月 31 日までにカレッジ大学病院の脳卒中ユニットで血行再建療法 (全身血栓溶解療法、血管内治療) を受けた急性虚血性脳卒中患者の単一中心の後ろ向き観察研究です。 患者のデータは、専用の登録簿に入力されます: 人口統計および臨床データ、ならびにこの研究でカバーされる血液化学および神経画像パラメータ。 病院到着時に収集され、介入の24時間後に繰り返される利用可能な循環バイオマーカーと神経画像が分析に含まれ、訪問または電話インタビューにより、修正ランキンスケールに従って脳卒中の3か月後に評価された臨床的/機能的結果が含まれます。

実験プロトコル:

私たちの大学病院では、急性虚血性脳卒中患者の血液サンプルは、再灌流治療 (静脈内血栓溶解療法または血管内血栓除去術) の前と 24 時間後に定期的に収集されます。 研究者は、以前の研究 (Piccardi et al. 2018) で既に使用されている血液サンプルを取得し、まだ正しく保存されており、生物学的バンクで利用できます。 次に、チューブを室温で 1500 x g で 15 分間遠心分離し、上清をアリコートにして -80 ° C で保存します。

ニューロ イメージング プロトコル:

非造影CT（NCCT）、CT血管造影（CTA）、CT灌流（CTP）を含むベースラインの神経画像評価は、治療時のガイドラインに従って指示された場合、急性介入の前に実施されています。 すべての患者で 24 時間のフォローアップ NCCT が実施されています。

24 時間後、国際的なガイドラインに従って、すべての患者は対照頭部 CT または脳 MRI を受けて、出血性変化、脳浮腫、および虚血領域の容積の存在を判断します。 取得済みの画像の再読み込みはDICOM形式で行います。 収集されたデータは、電子レジスターの特別なセクションに記録されます。

2 人の専門神経科医が各患者のベースラインと 24 時間 CT を個別に評価し、SITS-ISTR 基準に従って分類された脳浮腫の存在を記録します。半球の 3 分の 1、COED3 = 正中線シフトを伴う脳の腫れ、NONE = 脳浮腫の欠如。 2 人の独立した神経科医は、24 時間 CT スキャンで見える虚血性病変の手動マッピング (「マスク」) も作成します。 不一致は、経験豊富な神経放射線科医によって解決されます。 このプロセスでは、FSLeyes が使用されます。これは、FSL ソフトウェア (FMRIB ソフトウェア ライブラリ v6.0、Analysis Group、FMRIB、オックスフォード、英国によって作成された) に含まれるソフトウェアで、それぞれの 3 次元病変マスクを生成する可能性を提供します。患者、すべての CT セクションの梗塞組織をカバーします。 以前の虚血性転帰 (ベースライン CT で既に存在) は、マスクに含まれません。

解剖学的歪み (AD) は、ベースライン CT と 24 時間 CT を比較することによって評価されます。 この測定値を取得するために必要な手順には、「マスク」(前述) を使用して 24 時間目に見える虚血性病変の輪郭を描くことと、登録、異なる時間や個人であっても脳の異なる画像を正確に比較できる手順が含まれます。 AD は、2 つの可能なレジストレーション アプローチを比較することによって計算できます。特に、Harston らによって説明された方法に従って、線形レジストレーションと非線形レジストレーションによって処理された病変マスクの違いを定量化することによって計算できます。 2018年。 すべての画像処理と分析は、FSL ソフトウェア (FMRIB ソフトウェア ライブラリ v6.0、Analysis Group、FMRIB、オックスフォード、英国によって作成)、オックスフォード大学の研究グループによって開発された無料のアクセス ソフトウェアを使用して実行されます。

3か月の結果：全身血栓溶解療法または血管内治療で治療されたすべての患者は、発作イベントの3か月後に追跡され、修正ランキンスケールに従って臨床機能的結果が評価され、外来診療所で直接または電話でのインタビューが行われます.

したがって、このデータは外来患者のレポートから取得する必要があります。 データが不足している場合にのみ、電話インタビューが実施されます。

- 前臨床設定: 前臨床研究グループは、MCA の閉塞/再灌流の新しいマウス モデルを特徴付けます。 マウスを含むすべての手順は、イタリア保健省の認可 n の規則に従って実行されます。 723/2019。

マウスは、ケタミン (50 mg/kg) とキシラジン (9 mg/kg) で麻酔されます。 体温は加熱パッドで 37°C に維持されます。 マウスは、片側に横たわって、手術パッドに配置されます。 目と耳の間のマウスの毛を取り除き、皮膚をベタジンとエタノールで洗浄します。 その後、局所麻酔薬リドカイン 2% が適用されます。 鱗状骨の上の皮膚を刃で切り、筋肉を頭蓋骨から切り離し、そっと押し下げて骨を露出させます。

次に、歯科用ドリル (Silfradent、イタリア) を使用して小さな開頭術を行い、中大脳動脈の遠位枝を露出させます。 皮弁骨を取り除いたら、感光性染料であるローズベンガル（0.2 ml、10 mg/ml の生理食塩水溶液、Sigma Aldrich、米国）を腹腔内に注射します。 注射の５分後、５３２ｎｍレーザー（レーザーダイオードＣＰＳ５３２、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をＭＣＡ分岐の上流に２５分間集中させて、安定した血塊の形成を誘導する。 MCA の遠位枝の閉塞から 30 分後、血栓の破壊とそれに伴う血管の再開通を促進するために、研究者は同じ領域を 365 nm UV LED (ハイパワー LED SOLIS -365C、Thorlabs、ドイツ) 15 分間。 UV 照射期間の後、MCA 結果の遠位枝が再開通しました。 手順の最後に、筋肉が骨の上に置き換わり、皮膚が縫合されます。

実験時間枠の間に、研究者は再疎通の有無にかかわらず MCA の遠位枝の閉塞によって誘発される機能障害を特徴付けます。

この目的のために、調査員は、運動障害の程度を測定するための標準化された定性的評価に基づいて、2019年にBalbiと共同研究者によって適用されたプロトコルを修正する神経障害スコアを使用します（Bederson et al。1986）評価する5つの運動テストのパネルを採用強さ、バランス、内転と屈曲の能力。

マウスのサブグループでは、研究者は、遠位 MCA 閉塞の 24 時間後に血液脳関門の変化の出現を調査します。

この目的のために、研究者はマウスの尾静脈に 0.20 mL のエバンス ブルー染料 (0.20 mg/mL) を注入し、手術の最後に MCA の遠位枝を閉塞します。 注射の 24 時間後、動物はケタミン (50 mg/kg) とキシラジン (9 mg/kg) の過剰摂取で麻酔され、脳組織から血液を除去するために 100 mL の PBS で灌流されます。 次に、脳を抽出し、PFA 4% で 1 時間インキュベートします。 その後、脳は、厚さ 1 mm の約 15 スライスを生成する脳マトリックスで切断されます。

マウスの別のサブグループでは、研究者は、脳卒中誘導の7日後に病変の拡大とアストロサイトの動員を特徴付けます。

この目的のために、動物はケタミン (50 mg/kg) とキシラジン (9 mg/kg) の過剰摂取で麻酔され、4% パラホルムアルデヒドで経心的に灌流されます。 脳を振動ブレード ビブラトーム (ライカ、ドイツ) を使用して切断し、ニューロン マーカー、NeuN (1:1000、抗 NeuN ニワトリ、ミリポア、ドイツ)、およびグリア線維性酸性タンパク質、GFAP の免疫染色用に厚さ 100 μm の冠状切片を取得しました。 (1:1000、抗 GFAP ウサギ、アブカム、英国)。

NeuN 免疫染色は、光血栓症の 7 日後に脳卒中病変の体積を定量化するために実行されます。 各動物の一回拍出量は、損傷したすべての領域を合計し、その数値に切片の厚さと 4 (間隔係数) を掛けることによって計算されます。 画像は (Stemi 508、Carl Zeiss) で取得されます。 mm3 単位の総体積は、分析したすべての動物の平均 ± 標準誤差として与えられます。

グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）陽性ニューロンの数は、Nikon Plan EPO 60X対物レンズ（NA 1.4、油浸Nikon、東京、日本）を備えた共焦点蛍光顕微鏡（Nikon Eclipse TE 300、東京、日本）を使用して分析されます。 調査員は、4 つの関心領域、すなわち、梗塞周辺領域 (虚血境界ゾーン)、脳卒中コアから離れたイプシレシオナル半球の領域 (イプシレシオナル リモート ゾーン)、梗塞周辺領域の反対側の領域に調査を集中させます。 (反対側の虚血境界ゾーン)、および虚血性コアの反対側の健康な半球の領域 (対側の虚血性コア)。