Ictus isquémico agudo: del laboratorio a la cama del paciente (STROKELABED)

El objetivo del proyecto es evaluar la correlación de biomarcadores circulantes relacionados con la disrupción de la barrera hematoencefálica con el desarrollo de edema cerebral, transformación hemorrágica y extensión del área isquémica investigada con modernas técnicas de neuroimagen, con el fin de identificar predictores de lesión por reperfusión en pacientes sometidos a terapias de revascularización.

Paralelamente al estudio clínico, los investigadores investigarán aspectos mecanicistas sobre la correlación entre la degeneración neuronal y la alteración de la permeabilidad vascular. Con este fin, los investigadores utilizarán una combinación de técnicas de microscopía avanzadas y marcas fluorescentes vitales en un nuevo modelo de ratón de accidente cerebrovascular isquémico.

- Ámbito clínico: Se trata de un estudio observacional retrospectivo monocéntrico de pacientes con ictus isquémico agudo que se han sometido a terapias de revascularización (trombólisis sistémica, tratamiento endovascular) en la Unidad de Ictus del Hospital Universitario Careggi desde el 1 de octubre de 2015 hasta el 31 de mayo de 2020. Los datos de los pacientes se introducirán en un registro específico: datos demográficos y clínicos, así como parámetros hematoquímicos y de neuroimagen cubiertos por este estudio. Se incluirán en el análisis los biomarcadores circulantes disponibles y las neuroimágenes recogidas a la llegada al hospital y repetidas 24 horas después de las intervenciones, así como el resultado clínico/funcional evaluado 3 meses después del ictus según la escala de Rankin modificada mediante visita o entrevista telefónica.

Protocolo de laboratorio:

En nuestro hospital universitario, en pacientes con ictus isquémico agudo, las muestras de sangre se recogen de forma rutinaria antes y 24 horas después del tratamiento de reperfusión (ya sea trombólisis intravenosa o trombectomía endovascular). Los investigadores pudieron recuperar muestras de sangre ya utilizadas para un estudio anterior (Piccardi et al. 2018) y todavía almacenadas correctamente y disponibles en nuestro banco biológico: la sangre se recolecta en tubos tanto con anticoagulante como sin anticoagulante. A continuación, los tubos se centrifugan a temperatura ambiente a 1500 x g durante 15 minutos y el sobrenadante se almacena en alícuotas a -80 °C.

Protocolo de neuroimagen:

Se ha realizado una evaluación de neuroimagen inicial, incluida la TC sin contraste (NCCT), la angiografía por TC (CTA) y la perfusión por TC (CTP), antes de las intervenciones agudas cuando estaba indicado de acuerdo con las pautas vigentes en el momento del tratamiento. A todos los pacientes se les ha realizado un NCCT de seguimiento de 24 horas.

A las 24 horas, según las guías internacionales, a todos los pacientes se les realiza una TC craneal o una RM cerebral de control para determinar la presencia de transformación hemorrágica, edema cerebral y el volumen del área isquémica. La relectura de las imágenes ya adquiridas se realizará en formato DICOM. Los datos recabados quedarán registrados en un apartado especial del registro electrónico.

Dos neurólogos expertos evaluarán por separado la TC basal y de 24 horas de cada paciente y registrarán la presencia de edema cerebral clasificado según los criterios SITS-ISTR: COED1 = tumefacción cerebral focal hasta un tercio del hemisferio, COED2 = tumefacción cerebral focal mayor de un tercio del hemisferio, COED3 = edema cerebral con desplazamiento de la línea media, NINGUNO = ausencia de edema cerebral. Los dos neurólogos independientes también crearán un mapeo manual ("máscara") de la lesión isquémica visible en la tomografía computarizada de 24 horas. Cualquier discrepancia será resuelta por un neurorradiólogo experimentado. Para este proceso se utilizará FSLeyes, un software incluido en el software FSL (FMRIB Software Library v6.0, Creado por el Grupo de Análisis, FMRIB, Oxford, Reino Unido) que ofrece la posibilidad de generar una máscara de lesión tridimensional para cada paciente, cubriendo el tejido del infarto en todas las secciones de TC. Los resultados isquémicos previos (ya presentes en la TC inicial) no se incluirán en las máscaras.

La distorsión anatómica (DA) se evaluará comparando la TC de referencia con la TC de 24 horas. Los pasos necesarios para obtener esta medida incluyen la delimitación de la lesión isquémica visible a las 24 horas mediante una "máscara" (descrita anteriormente) y el registro, procedimiento que permite comparar con precisión diferentes imágenes del cerebro, incluso en diferentes momentos e individuos. AD se puede calcular comparando los dos enfoques de registro posibles y, en particular, cuantificando la diferencia entre las máscaras de lesión procesadas a través del registro lineal y no lineal según el método descrito por Harston et al. en 2018. Todo el procesamiento y análisis de imágenes se llevará a cabo utilizando el software FSL (FMRIB Software Library v6.0, Creado por el Grupo de Análisis, FMRIB, Oxford, Reino Unido), un software de libre acceso desarrollado por un grupo de investigación de la Universidad de Oxford.

Evolución a los 3 meses: Todos los pacientes tratados con trombólisis sistémica o tratamiento endovascular son seguidos a los 3 meses del evento ictal con evaluación del resultado clínico-funcional según la Escala de Rankin modificada, directamente en consulta externa o mediante entrevista telefónica .

Por lo tanto, estos datos deben obtenerse de los informes de pacientes ambulatorios. Solo si faltan los datos se realizará una entrevista telefónica.

- Entorno preclínico: el grupo de investigación preclínica caracterizará un nuevo modelo de ratón de oclusión/reperfusión de la ACM. Todos los procedimientos que involucren ratones se realizarán de acuerdo con las regulaciones del Ministerio de Salud italiano autorización n. 723/2019.

Los ratones se anestesiarán con ketamina (50 mg/kg) y xilazina (9 mg/kg). La temperatura corporal se mantendrá a 37°C con una almohadilla térmica. Los ratones se colocarán sobre una almohadilla quirúrgica, tumbados sobre un lado. Se eliminarán los pelos de ratón entre el ojo y la oreja y luego se limpiará la piel con betadina y etanol. Luego se aplicará el anestésico local lidocaína al 2%. Se cortará la piel sobre el hueso escamoso con una cuchilla, se separará el músculo del cráneo y se empujará suavemente hacia abajo para exponer el hueso.

Luego, se utilizará un taladro dental (Silfradent, Italia) para crear una pequeña craneotomía para exponer la rama distal de la arteria cerebral media. Una vez retirado el hueso del colgajo, se inyectará por vía intraperitoneal un tinte fotosensible, Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml de solución en solución salina; Sigma Aldrich, EE. UU.). Cinco minutos después de la inyección, se enfocará un láser de 532 nm (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Alemania) aguas arriba de la ramificación MCA durante veinticinco minutos para inducir la formación de un coágulo estable. Treinta minutos después de la oclusión de la rama distal de la ACM, con el fin de promover la ruptura del coágulo y la consiguiente recanalización del vaso sanguíneo, los investigadores iluminarán la misma región con un LED UV de 365 nm (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Alemania) durante quince minutos. Después del período de irradiación UV, la rama distal de la ACM resultó recanalizada. Al final del procedimiento, se reemplazará el músculo sobre el hueso y se suturará la piel.

Durante la ventana de tiempo experimental, los investigadores caracterizarán el deterioro funcional inducido por la oclusión de la rama distal de la ACM con y sin recanalización.

Para ello, los investigadores utilizarán la escala de neurodéficit modificando el protocolo aplicado por Balbi y colaboradores en 2019, basado en una evaluación cualitativa estandarizada para medir el grado de deterioro motor (Bederson et al. 1986) empleando un panel de cinco pruebas motoras para evaluar fuerza, equilibrio y capacidad de aducción y flexión.

En un subgrupo de ratones, los investigadores investigarán la aparición de alteraciones de la barrera hematoencefálica 24 horas después de la oclusión distal de la ACM.

Para ello, los investigadores inyectarán en la vena de la cola del ratón 0,20 ml de colorante azul de Evans (0,20 mg/ml), al final de la cirugía para ocluir la rama distal de la ACM. 24 horas después de la inyección, el animal será anestesiado con una sobredosis de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (9 mg/kg) y luego perfundido con 100 ml de PBS para eliminar la sangre del tejido cerebral. A continuación, se extraerá el cerebro y se incubará en PFA al 4 % durante una hora. Luego se seccionará el cerebro con una matriz cerebral produciendo aproximadamente 15 cortes de 1 mm de espesor.

En otro subgrupo de ratones, los investigadores caracterizarán la extensión de la lesión y el reclutamiento de astrocitos 7 días después de la inducción del accidente cerebrovascular.

Para ello, los animales serán anestesiados con una sobredosis de ketamina (50 mg/kg) y xilazina (9 mg/kg) y luego perfundidos transcardiacamente con paraformaldehído al 4%. Los cerebros se cortaron con un vibratomo de cuchilla vibratoria (Leica, Alemania) para obtener secciones coronales de 100 µm de espesor para la inmunotinción del marcador neuronal, NeuN (1:1000, pollo anti-NeuN, Millipore, Alemania) y proteína ácida fibrilar glial, GFAP (1:1000, conejo anti-GFAP, Abcam, Reino Unido).

La inmunotinción de NeuN se realizará para cuantificar el volumen de la lesión por accidente cerebrovascular 7 días después de la fototrombosis. El volumen sistólico de cada animal se calculará sumando todas las áreas dañadas y multiplicando el número por el grosor de la sección y por 4 (el factor de espaciado). Las imágenes se adquirirán con un (Stemi 508, Carl Zeiss). El volumen total en mm3 se dará como la media ± error estándar de todos los animales analizados.

El número de neuronas positivas para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) se analizará utilizando un microscopio de fluorescencia confocal (Nikon Eclipse TE 300, Tokio, Japón) con un objetivo Nikon Plan EPO 60X (NA 1.4, inmersión en aceite Nikon, Tokio, Japón). Los investigadores centrarán nuestra investigación en 4 regiones de interés, es decir, el área periinfarto (zona fronteriza isquémica), una región en el hemisferio ipsilesional distante del núcleo del accidente cerebrovascular (zona remota ipsilesional), una región contralateral al área periinfarto (zona fronteriza isquémica contralateral), y una región en el hemisferio sano contralateral al núcleo isquémico (núcleo isquémico contralateral).