Острый ишемический инсульт: из лаборатории на койку больного (STROKELABED)

Цель проекта — оценить взаимосвязь циркулирующих биомаркеров, связанных с нарушением гематоэнцефалического барьера, с развитием отека мозга, геморрагической трансформацией и расширением зоны ишемии, исследуемой с помощью современных методов нейровизуализации, с целью выявления предикторов реперфузионного повреждения у пациентов, перенесших реваскуляризирующую терапию.

Параллельно с клиническим исследованием исследователи будут изучать механистические аспекты корреляции между дегенерацией нейронов и изменением сосудистой проницаемости. С этой целью исследователи будут использовать комбинацию передовых методов микроскопии и жизненно важных флуоресцентных меток в новой мышиной модели ишемического инсульта.

- Клинические условия: это моноцентровое ретроспективное обсервационное исследование пациентов с острым ишемическим инсультом, перенесших реваскуляризирующую терапию (системный тромболизис, эндоваскулярное лечение) в отделении инсульта университетской больницы Кареджи с 1 октября 2015 года по 31 мая 2020 года. Данные пациентов будут внесены в специальный реестр: демографические и клинические данные, а также гематохимические и нейровизуализационные параметры, охваченные этим исследованием. Доступные циркулирующие биомаркеры и данные нейровизуализации, собранные при поступлении в больницу и повторенные через 24 часа после вмешательства, будут включены в анализ, а также клинический/функциональный результат, оцененный через 3 месяца после инсульта в соответствии с модифицированной шкалой Рэнкина путем визита или телефонного интервью.

Лабораторный протокол:

В нашей университетской больнице у пациентов с острым ишемическим инсультом образцы крови обычно собирают до и через 24 часа после реперфузионного лечения (либо внутривенного тромболизиса, либо эндоваскулярной тромбэктомии). Исследователи смогли получить образцы крови, уже использованные для предыдущего исследования (Piccardi et al. 2018) и все еще правильно хранящиеся и доступные в нашем биологическом банке: кровь собирается в пробирки как с антикоагулянтом, так и без антикоагулянта. Затем пробирки центрифугируют при комнатной температуре при 1500 x g в течение 15 минут, а супернатант хранят аликвотами при -80°C.

Протокол нейровизуализации:

Базовая оценка нейровизуализации, включая бесконтрастную КТ (NCCT), КТ-ангиографию (CTA) и CT-перфузию (CTP), выполнялась перед неотложными вмешательствами, когда это было показано в соответствии с рекомендациями, действующими на момент лечения. Всем больным проведено 24-часовое динамическое наблюдение.

Через 24 часа, согласно международным рекомендациям, всем пациентам проводят контрольную КТ головы или МРТ головного мозга для определения наличия геморрагической трансформации, отека мозга и объема зоны ишемии. Повторное считывание уже полученных изображений будет осуществляться в формате DICOM. Собранные данные будут занесены в специальный раздел электронного реестра.

Два опытных невролога отдельно оценят исходный уровень и 24-часовую КТ каждого пациента и зафиксируют наличие отека мозга, классифицированного в соответствии с критериями SITS-ISTR: COED1 = очаговый отек мозга до одной трети полушария, COED2 = очаговый отек мозга более одна треть полушария, COED3 = отек мозга со смещением средней линии, NONE = отсутствие отека мозга. Два независимых невролога также создадут ручную карту («маску») ишемического поражения, видимого на 24-часовой компьютерной томографии. Любые несоответствия будут устранены опытным нейрорадиологом. Для этого процесса будет использоваться FSLeyes, программное обеспечение, включенное в программное обеспечение FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created the Analysis Group, FMRIB, Оксфорд, Великобритания), которое предлагает возможность создания трехмерной маски поражения для каждого пациента, покрывающую инфарктную ткань на всех КТ-срезах. Предыдущие исходы ишемии (уже присутствующие на базовой КТ) не будут включены в маски.

Анатомическое искажение (AD) будет оцениваться путем сравнения базовой КТ с 24-часовой КТ. Шаги, необходимые для получения этого измерения, включают очертание ишемического поражения, видимого через 24 часа, с использованием «маски» (описанной ранее) и регистрацию, процедуру, которая позволяет точно сравнивать различные изображения мозга, даже в разное время и у разных людей. AD можно рассчитать путем сравнения двух возможных подходов к регистрации и, в частности, путем количественной оценки разницы между масками поражений, обработанными с помощью линейной и нелинейной регистрации в соответствии с методом, описанным Harston et al. в 2018 году. Вся обработка и анализ изображений будут выполняться с использованием программного обеспечения FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created the Analysis Group, FMRIB, Оксфорд, Великобритания), бесплатного программного обеспечения, разработанного исследовательской группой Оксфордского университета.

Результат через 3 месяца: Все пациенты, получавшие системный тромболизис или эндоваскулярное лечение, находятся под наблюдением через 3 месяца после иктального события с оценкой клинико-функционального результата по модифицированной шкале Рэнкина, непосредственно в амбулаторных условиях или по телефону. .

Поэтому эти данные должны быть получены из амбулаторных отчетов. Только в случае отсутствия данных будет проведено телефонное интервью.

- Доклинические условия: Группа доклинических исследований охарактеризует новую модель мышиной окклюзии/реперфузии СМА. Все процедуры с участием мышей будут проводиться в соответствии с положениями разрешения Министерства здравоохранения Италии n. 723/2019.

Мышей анестезируют кетамином (50 мг/кг) и ксилазином (9 мг/кг). Температуру тела поддерживают на уровне 37°C с помощью грелки. Мышей помещают на операционную подушку, лежащую на одном боку. Мышиные волосы между глазом и ухом будут удалены, а затем кожа будет очищена бетадином и этанолом. Затем будет применен местный анестетик лидокаин 2%. Кожа над чешуйчатой ​​костью будет разрезана лезвием, мышца будет отделена от черепа и осторожно сдвинута вниз, чтобы обнажить кость.

Затем с помощью стоматологической бормашины (Silfradent, Италия) будет создана небольшая трепанация черепа, чтобы обнажить дистальную ветвь средней мозговой артерии. После удаления лоскута внутрибрюшинно вводят фоточувствительный краситель Rosebengal (0,2 мл, 10 мг/мл раствор в физиологическом растворе; Sigma Aldrich, США). Через пять минут после инъекции лазер с длиной волны 532 нм (лазерный диод CPS532, Thorlabs, Германия) будет фокусироваться вверх по течению от разветвления СМА в течение двадцати пяти минут, чтобы вызвать образование стабильного сгустка. Через 30 минут после окклюзии дистальной ветви СМА, чтобы способствовать разрушению сгустка и последующей реканализации кровеносного сосуда, исследователи освещают ту же область УФ-светодиодом 365 нм (High-Power LED SOLIS). -365C, Thorlabs, Германия) в течение пятнадцати минут. После периода УФ-облучения дистальная ветвь СМА в результате реканализации. В конце процедуры мышца будет заменена на кость, а кожа зашита.

В течение экспериментального временного окна исследователи будут характеризовать функциональные нарушения, вызванные окклюзией дистальной ветви СМА с реканализацией и без нее.

С этой целью исследователи будут использовать шкалу нейродефицита, модифицирующую протокол, примененный Бальби и соавторами в 2019 г., на основе стандартизированной качественной оценки для измерения степени двигательных нарушений (Bederson et al., 1986) с использованием панели из пяти двигательных тестов для оценки сила, равновесие, способность приведения и сгибания.

В подгруппе мышей исследователи изучат появление изменений гематоэнцефалического барьера через 24 часа после дистальной окклюзии СМА.

С этой целью исследователи будут вводить в хвостовую вену мыши 0,20 мл красителя Evans Blue (0,20 мг/мл) в конце операции, чтобы закрыть дистальную ветвь СМА. Через 24 часа после инъекции животное анестезируют передозировкой кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (9 мг/кг), а затем перфузируют 100 мл PBS для удаления крови из ткани головного мозга. Затем мозг извлекают и инкубируют в 4% PFA в течение одного часа. Затем мозг будет срезан с матрицей мозга, в результате чего получится примерно 15 срезов толщиной 1 мм.

В другой подгруппе мышей исследователи будут характеризовать расширение поражения и рекрутирование астроцитов через 7 дней после индукции инсульта.

С этой целью животных анестезируют передозировкой кетамина (50 мг/кг) и ксилазина (9 мг/кг), а затем транскардиально перфузируют 4% параформальдегидом. Мозг разрезали с помощью вибратома с вибрирующим лезвием (Leica, Германия) для получения корональных срезов толщиной 100 мкм для иммунного окрашивания нейронального маркера, NeuN (1:1000, анти-NeuN цыпленка, Millipore, Германия) и глиального фибриллярного кислого белка, GFAP. (1:1000, кролик против GFAP, Abcam, Великобритания).

Иммуноокрашивание NeuN будет проводиться для количественной оценки объема инсульта через 7 дней после фототромбоза. Ударный объем для каждого животного будет рассчитываться путем суммирования всех поврежденных участков и умножения числа на толщину среза и на 4 (коэффициент расстояния). Изображения будут получены с помощью (Stemi 508, Carl Zeiss). Общий объем в мм3 будет дан как среднее ± стандартная ошибка всех проанализированных животных.

Количество нейронов, положительных по протеину глиальной фибриллярной кислоты (GFAP), будет проанализировано с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа (Nikon Eclipse TE 300, Токио, Япония) с объективом Nikon Plan EPO 60X (NA 1,4, масляная иммерсия Nikon, Токио, Япония). Исследователи сосредоточат наше исследование на 4 областях, представляющих интерес, т. е. периинфарктная область (ишемическая пограничная зона), область в ипсилезиональном полушарии, удаленная от ядра инсульта (ипсилезная удаленная зона), область, контралатеральная периинфарктной области. (контралатеральная пограничная зона ишемии) и область в здоровом полушарии, контралатеральная по отношению к ишемическому ядру (контралатеральное ишемическое ядро).