Ostry udar niedokrwienny: od laboratorium do łóżka pacjenta (STROKELABED)

Celem projektu jest ocena korelacji krążących biomarkerów związanych z przerwaniem bariery krew-mózg z rozwojem obrzęku mózgu, transformacją krwotoczną i poszerzeniem obszaru niedokrwienia badanego nowoczesnymi technikami neuroobrazowania, w celu identyfikacji predyktorów uszkodzenia reperfuzyjnego w pacjentów poddawanych terapii rewaskularyzacyjnej.

Równolegle z badaniami klinicznymi badacze będą badać mechanistyczne aspekty korelacji między degeneracją neuronów a zmianą przepuszczalności naczyń. W tym celu badacze wykorzystają połączenie zaawansowanych technik mikroskopowych i żywych oznaczeń fluorescencyjnych w nowym mysim modelu udaru niedokrwiennego.

- Sytuacja kliniczna: Jest to monocentryczne retrospektywne badanie obserwacyjne pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym, którzy przeszli terapie rewaskularyzacyjne (tromboliza ogólnoustrojowa, leczenie wewnątrznaczyniowe) na Oddziale Udarowym Szpitala Uniwersyteckiego Careggi w okresie od 1 października 2015 r. do 31 maja 2020 r. Dane pacjentów zostaną wpisane do dedykowanego rejestru: dane demograficzne i kliniczne oraz parametry hematochemiczne i neuroobrazowe objęte tym badaniem. W analizie uwzględnione zostaną dostępne krążące biomarkery i neuroobrazowanie zebrane po przybyciu do szpitala i powtórzone 24 godziny po interwencji, a także wynik kliniczny/funkcjonalny oceniony 3 miesiące po udarze według zmodyfikowanej skali Rankina podczas wizyty lub wywiadu telefonicznego.

Protokół laboratoryjny:

W naszym szpitalu uniwersyteckim od pacjentów z ostrym udarem niedokrwiennym rutynowo pobiera się próbki krwi przed i 24 godziny po leczeniu reperfuzyjnym (tromboliza dożylna lub trombektomia wewnątrznaczyniowa). Badacze mogli pobrać próbki krwi, które były już wykorzystane w poprzednim badaniu (Piccardi et al. 2018) i nadal prawidłowo przechowywane i dostępne w naszym banku biologicznym: krew jest pobierana do probówek zarówno z antykoagulantem, jak i bez antykoagulantu. Następnie probówki wiruje się w temperaturze pokojowej przy 1500 x g przez 15 minut, a supernatant przechowuje w porcjach w temperaturze -80°C.

Protokół neuroobrazowania:

Wyjściową ocenę neuroobrazowania, w tym tomografię komputerową bez kontrastu (NCCT), angiografię tomografii komputerowej (CTA) i perfuzję tomografii komputerowej (CTP), przeprowadzono przed pilnymi interwencjami, jeśli było to wskazane zgodnie z wytycznymi obowiązującymi w czasie leczenia. U wszystkich pacjentów wykonano 24-godzinną obserwację NCCT.

Po 24 godzinach, zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi, wszyscy pacjenci poddawani są kontrolnemu badaniu CT głowy lub MRI mózgu w celu określenia obecności transformacji krwotocznej, obrzęku mózgu oraz objętości obszaru niedokrwienia. Ponowne odczytanie już pozyskanych obrazów zostanie przeprowadzone w formacie DICOM. Zebrane dane zostaną zapisane w specjalnej sekcji rejestru elektronicznego.

Dwóch ekspertów neurologów oddzielnie oceni wyjściową i 24-godzinną tomografię komputerową każdego pacjenta i odnotuje obecność obrzęku mózgu sklasyfikowanego zgodnie z kryteriami SITS-ISTR: COED1 = ogniskowy obrzęk mózgu do jednej trzeciej półkuli, COED2 = ogniskowy obrzęk mózgu większy niż jedna trzecia półkuli, COED3 = obrzęk mózgu z przesunięciem linii środkowej, BRAK = brak obrzęku mózgu. Dwaj niezależni neurolodzy stworzą również ręczne mapowanie („maskę”) zmiany niedokrwiennej widocznej na 24-godzinnym tomografii komputerowej. Wszelkie rozbieżności wyjaśni doświadczony neuroradiolog. W tym procesie zostanie użyte FSLeyes, oprogramowanie zawarte w oprogramowaniu FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), które oferuje możliwość wygenerowania trójwymiarowej maski zmian dla każdego pacjenta, pokrywając tkankę zawału na wszystkich skrawkach CT. Wcześniejsze wyniki niedokrwienne (już obecne w wyjściowym badaniu CT) nie zostaną uwzględnione w maskach.

Zniekształcenie anatomiczne (AD) zostanie ocenione poprzez porównanie wyjściowego CT z 24-godzinnym CT. Kroki wymagane do uzyskania tego pomiaru obejmują nakreślenie zmiany niedokrwiennej widocznej po 24 godzinach przy użyciu „maski” (opisanej wcześniej) i rejestrację, procedurę, która pozwala dokładnie porównać różne obrazy mózgu, nawet w różnym czasie i u różnych osób. AD można obliczyć, porównując dwa możliwe podejścia do rejestracji, aw szczególności określając ilościowo różnicę między maskami uszkodzeń przetworzonymi przez rejestrację liniową i nieliniową zgodnie z metodą opisaną przez Harstona i in. w 2018 roku Całe przetwarzanie i analiza obrazu zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania FSL (FMRIB Software Library v6.0, stworzonego przez Analysis Group, FMRIB, Oxford, Wielka Brytania), bezpłatnego oprogramowania opracowanego przez grupę badawczą Uniwersytetu Oksfordzkiego.

Wynik po 3 miesiącach: Wszyscy pacjenci leczeni trombolizą systemową lub leczeniem wewnątrznaczyniowym są kontrolowani po 3 miesiącach od incydentu z oceną wyniku kliniczno-czynnościowego według zmodyfikowanej skali Rankina, bezpośrednio w poradni lub przez wywiad telefoniczny .

Dane te należy zatem pozyskać z raportów ambulatoryjnych. Tylko w przypadku braku danych zostanie przeprowadzony wywiad telefoniczny.

- Warunki przedkliniczne: grupa badań przedklinicznych scharakteryzuje nowy mysi model okluzji/reperfuzji MCA. Wszystkie zabiegi z udziałem myszy będą wykonywane zgodnie z przepisami włoskiego zezwolenia Ministerstwa Zdrowia nr. 723/2019.

Myszy będą znieczulane ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (9 mg/kg). Temperatura ciała będzie utrzymywana na poziomie 37°C za pomocą poduszki grzewczej. Myszy zostaną umieszczone na podkładce chirurgicznej, leżącej z jednej strony. Włosy myszy między okiem a uchem zostaną usunięte, a następnie skóra zostanie oczyszczona betadyną i etanolem. Następnie zostanie zastosowana miejscowa lidokaina o stężeniu 2%. Skóra nad kością łuskowatą zostanie nacięta ostrzem, mięsień zostanie oddzielony od czaszki i delikatnie dociśnięty, aby odsłonić kość.

Następnie za pomocą wiertła dentystycznego (Silfradent, Italia) zostanie wykonana mała kraniotomia w celu odsłonięcia dystalnej gałęzi tętnicy środkowej mózgu. Po usunięciu płata kości, światłoczuły barwnik Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml roztwór w roztworze soli fizjologicznej; Sigma Aldrich, USA) zostanie wstrzyknięty dootrzewnowo. Pięć minut po wstrzyknięciu laser 532 nm (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Niemcy) będzie skupiany przed rozgałęzieniem MCA przez dwadzieścia pięć minut, aby wywołać tworzenie stabilnego skrzepu. Trzydzieści minut po okluzji dystalnej gałęzi MCA, w celu przyspieszenia przerwania skrzepu i w konsekwencji rekanalizacji naczynia krwionośnego, badacze oświetlą ten sam obszar za pomocą diody LED UV 365 nm (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Niemcy) przez piętnaście minut. Po okresie naświetlania UV dystalna gałąź MCA uległa rekanalizacji. Pod koniec zabiegu mięsień zostanie zastąpiony kością, a skóra zszyta.

Podczas eksperymentalnego okna czasowego badacze scharakteryzują upośledzenie czynnościowe wywołane okluzją dystalnej gałęzi MCA z rekanalizacją i bez rekanalizacji.

W tym celu badacze wykorzystają punktację neurodeficit modyfikującą protokół zastosowany przez Balbi i współpracowników w 2019 r., opartą na wystandaryzowanej ocenie jakościowej do pomiaru stopnia upośledzenia motorycznego (Bederson et al. 1986) wykorzystującą panel pięciu testów motorycznych do oceny siłę, równowagę oraz zdolność przywodzenia i zginania.

W podgrupie myszy badacze zbadają pojawianie się zmian w barierze krew-mózg 24 godziny po dystalnej okluzji MCA.

W tym celu badacze wstrzykną do żyły ogonowej myszy 0,20 ml barwnika Evans Blue (0,20 mg/ml) pod koniec operacji, aby zamknąć dystalną gałąź MCA. 24 godziny po wstrzyknięciu zwierzę zostanie znieczulone przedawkowaną ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (9 mg/kg), a następnie poddane perfuzji 100 ml PBS w celu usunięcia krwi z tkanki mózgowej. Następnie mózg zostanie wyekstrahowany i inkubowany w 4% PFA przez jedną godzinę. Następnie mózg zostanie podzielony na skrawki z matrycą mózgową, z której powstanie około 15 warstw o ​​grubości 1 mm.

W innej podgrupie myszy badacze scharakteryzują rozszerzenie zmian chorobowych i rekrutację astrocytów 7 dni po indukcji udaru.

W tym celu zwierzęta zostaną znieczulone przedawkowaną ketaminą (50 mg/kg) i ksylazyną (9 mg/kg), a następnie poddane perfuzji przezsercowej 4% paraformaldehydem. Mózgi wycięto za pomocą wibratomu z wibrującym ostrzem (Leica, Niemcy) w celu uzyskania skrawków koronowych o grubości 100 µm do barwienia immunologicznego markera neuronalnego, NeuN (1: 1000, kurczak anty-NeuN, Millipore, Niemcy) i kwaśnego białka włóknistego gleju, GFAP (1:1000, królik anty-GFAP, Abcam, Wielka Brytania).

Immunobarwienie NeuN zostanie przeprowadzone w celu ilościowego określenia objętości zmiany udarowej 7 dni po fotozakrzepicy. Objętość wyrzutowa dla każdego zwierzęcia zostanie obliczona przez zsumowanie wszystkich uszkodzonych obszarów i pomnożenie liczby przez grubość cięcia i przez 4 (współczynnik odstępu). Obrazy będą pozyskiwane za pomocą (Stemi 508, Carl Zeiss). Całkowita objętość w mm3 zostanie podana jako średnia ± błąd standardowy wszystkich analizowanych zwierząt.

Liczba neuronów dodatnich pod względem białka włóknistego gleju (GFAP) zostanie przeanalizowana przy użyciu konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego (Nikon Eclipse TE 300, Tokio, Japonia) z obiektywem Nikon Plan EPO 60X (NA 1,4, zanurzenie w olejku Nikon, Tokio, Japonia). Badacze skoncentrują nasze badania na 4 obszarach zainteresowania, tj. obszarze okołozawałowym (strefa graniczna niedokrwienia), regionie półkuli ipsilesional odległym od rdzenia udaru (strefa odległa ipsilesional), regionie przeciwległym do obszaru okołozawałowego (kontralateralna strefa graniczna niedokrwienia) oraz region w zdrowej półkuli przeciwny do rdzenia niedokrwiennego (kontralateralny rdzeń niedokrwienny).