Akuter ischämischer Schlaganfall: Vom LABOR zum Patientenbett (STROKELABED)

Ziel des Projekts ist es, die Korrelation zirkulierender Biomarker im Zusammenhang mit einer Störung der Blut-Hirn-Schranke mit der Entwicklung von Hirnödemen, hämorrhagischen Transformationen und der Erweiterung des ischämischen Bereichs zu bewerten, die mit modernen bildgebenden Verfahren untersucht wurden, um Prädiktoren für eine Reperfusionsverletzung zu identifizieren Patienten, die sich Revaskularisierungstherapien unterziehen.

Parallel zur klinischen Studie werden die Forscher mechanistische Aspekte zum Zusammenhang zwischen neuronaler Degeneration und der Veränderung der Gefäßpermeabilität untersuchen. Zu diesem Zweck werden die Forscher eine Kombination aus fortschrittlichen Mikroskopietechniken und lebenswichtigen fluoreszierenden Markierungen in einem neuartigen Mausmodell des ischämischen Schlaganfalls verwenden.

- Klinisches Setting: Dies ist eine monozentrische retrospektive Beobachtungsstudie an Patienten mit akutem ischämischem Schlaganfall, die sich vom 1. Oktober 2015 bis 31. Mai 2020 auf der Stroke Unit des Careggi University Hospital einer Revaskularisierungstherapie (systemische Thrombolyse, endovaskuläre Behandlung) unterzogen haben. Die Daten der Patienten werden in ein spezielles Register eingegeben: Demografische und klinische Daten sowie hämatochemische und neuroimaging Parameter, die von dieser Studie abgedeckt werden. Verfügbare zirkulierende Biomarker und Neuroimaging, die bei der Ankunft im Krankenhaus gesammelt und 24 Stunden nach den Eingriffen wiederholt wurden, werden in die Analyse einbezogen, ebenso wie das klinische/funktionelle Ergebnis, das 3 Monate nach dem Schlaganfall gemäß der modifizierten Rankin-Skala durch einen Besuch oder ein Telefoninterview bewertet wird.

Laborprotokoll:

In unserer Universitätsklinik werden bei Patienten mit akutem ischämischem Schlaganfall vor und 24 Stunden nach einer Reperfusionsbehandlung (entweder intravenöse Thrombolyse oder endovaskuläre Thrombektomie) routinemäßig Blutproben entnommen. Die Forscher konnten Blutproben abrufen, die bereits für eine frühere Studie (Piccardi et al. 2018) verwendet wurden und noch korrekt gelagert und in unserer biologischen Bank verfügbar sind: Blut wird in Röhrchen sowohl mit Antikoagulans als auch ohne Antikoagulans gesammelt. Die Röhrchen werden dann bei Raumtemperatur bei 1500 x g für 15 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wird in Aliquots bei -80 °C gelagert.

Neuroimaging-Protokoll:

Eine bildgebende Grunduntersuchung, einschließlich Non-Contrast CT (NCCT), CT-Angiographie (CTA) und CT-Perfusion (CTP), wurde vor akuten Eingriffen durchgeführt, wenn dies gemäß den zum Zeitpunkt der Behandlung geltenden Richtlinien angezeigt war. Bei allen Patienten wurde ein 24-Stunden-Follow-up-NCCT durchgeführt.

Nach 24 Stunden werden alle Patienten gemäß internationalen Richtlinien einer Kontrollkopf-CT oder Gehirn-MRT unterzogen, um das Vorhandensein einer hämorrhagischen Transformation, eines Hirnödems und des Volumens des ischämischen Bereichs zu bestimmen. Das erneute Lesen der bereits erfassten Bilder erfolgt im DICOM-Format. Die erhobenen Daten werden in einem speziellen Abschnitt des elektronischen Registers erfasst.

Zwei erfahrene Neurologen werten den Ausgangswert und das 24-Stunden-CT jedes Patienten separat aus und zeichnen das Vorhandensein eines Hirnödems auf, das gemäß den SITS-ISTR-Kriterien klassifiziert ist: COED1 = fokale Hirnschwellung bis zu einem Drittel der Hemisphäre, COED2 = fokale Hirnschwellung größer als ein Drittel der Hemisphäre, COED3 = Hirnschwellung mit Mittellinienverschiebung, NONE = Fehlen eines Hirnödems. Die beiden unabhängigen Neurologen werden auch eine manuelle Abbildung ("Maske") der ischämischen Läsion erstellen, die auf dem 24-Stunden-CT-Scan sichtbar ist. Etwaige Unstimmigkeiten werden von einem erfahrenen Neuroradiologen geklärt. Für diesen Prozess wird FSLeyes verwendet, eine Software, die in der FSL-Software enthalten ist (FMRIB Software Library v6.0, erstellt von der Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), die die Möglichkeit bietet, für jede eine dreidimensionale Läsionsmaske zu generieren Patient , der das Infarktgewebe auf allen CT-Schnitten abdeckt. Frühere ischämische Ergebnisse (bereits im Ausgangs-CT vorhanden) werden nicht in die Masken aufgenommen.

Die anatomische Verzerrung (AD) wird durch Vergleich des Ausgangs-CT mit dem 24-Stunden-CT beurteilt. Die erforderlichen Schritte, um diese Messung zu erhalten, umfassen das Abgrenzen der nach 24 Stunden sichtbaren ischämischen Läsion unter Verwendung einer "Maske" (oben beschrieben) und die Registrierung, ein Verfahren, das es ermöglicht, verschiedene Bilder des Gehirns genau zu vergleichen, sogar zu verschiedenen Zeiten und Personen. AD kann berechnet werden, indem die zwei möglichen Registrierungsansätze verglichen werden und insbesondere durch Quantifizierung der Differenz zwischen den Läsionsmasken, die durch lineare und nicht-lineare Registrierung gemäß dem von Harston et al. beschriebenen Verfahren verarbeitet werden. im Jahr 2018. Die gesamte Bildverarbeitung und -analyse wird mit der FSL-Software (FMRIB Software Library v6.0, erstellt von der Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) durchgeführt, einer frei zugänglichen Software, die von einer Forschungsgruppe der Universität Oxford entwickelt wurde.

3-Monats-Outcome: Alle Patienten, die mit systemischer Thrombolyse oder endovaskulärer Behandlung behandelt wurden, werden 3 Monate nach dem iktalen Ereignis mit einer Bewertung des klinisch-funktionellen Outcome nach der modifizierten Rankin-Skala direkt in der Ambulanz oder per Telefoninterview nachuntersucht .

Diese Daten müssen daher aus ambulanten Berichten gewonnen werden. Nur bei fehlenden Daten wird ein Telefoninterview durchgeführt.

- Präklinisches Setting: Die präklinische Forschungsgruppe wird ein neuartiges Mausmodell der Okklusion/Reperfusion der MCA charakterisieren. Alle Verfahren mit Mäusen werden gemäß den Vorschriften des italienischen Gesundheitsministeriums mit der Genehmigung Nr. 723/2019.

Mäuse werden mit Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (9 mg/kg) anästhesiert. Die Körpertemperatur wird mit einem Heizkissen auf 37°C gehalten. Die Mäuse werden auf einer Seite liegend auf eine OP-Unterlage gelegt. Die Maushaare zwischen Auge und Ohr werden entfernt und anschließend wird die Haut mit Betadin und Ethanol gereinigt. Anschließend wird das Lokalanästhetikum Lidocain 2 % appliziert. Die Haut über dem Plattenbein wird mit einer Klinge geschnitten, der Muskel wird vom Schädel gelöst und sanft nach unten gedrückt, um den Knochen freizulegen.

Dann wird ein Zahnbohrer (Silfradent, Italien) verwendet, um eine kleine Kraniotomie anzulegen, um den distalen Ast der mittleren Hirnarterie freizulegen. Sobald der Lappenknochen entfernt ist, wird ein lichtempfindlicher Farbstoff, Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml Lösung in Kochsalzlösung; Sigma Aldrich, USA) intraperitoneal injiziert. Fünf Minuten nach der Injektion wird ein 532-nm-Laser (Laserdiode CPS532, Thorlabs, Deutschland) 25 Minuten lang stromaufwärts der MCA-Verzweigung fokussiert, um die Bildung eines stabilen Gerinnsels zu induzieren. Dreißig Minuten nach dem Verschluss des distalen Astes der MCA beleuchten die Untersucher denselben Bereich mit einer 365-nm-UV-LED (High-Power LED SOLIS -365°C, Thorlabs, Deutschland) für 15 Minuten. Nach der UV-Bestrahlungszeit wird der distale Ast des MCA-Ergebnisses rekanalisiert. Am Ende des Eingriffs wird der Muskel wieder über den Knochen gelegt und die Haut vernäht.

Während des experimentellen Zeitfensters werden die Forscher die funktionelle Beeinträchtigung charakterisieren, die durch den Verschluss des distalen Astes der MCA mit und ohne Rekanalisation induziert wird.

Zu diesem Zweck werden die Ermittler den Neurodefizit-Score verwenden, der das von Balbi und Mitarbeitern im Jahr 2019 angewendete Protokoll modifiziert, basierend auf einer standardisierten qualitativen Bewertung zur Messung des Grades der motorischen Beeinträchtigung (Bederson et al. 1986), wobei ein Panel von fünf motorischen Tests zur Bewertung verwendet wird Kraft, Gleichgewicht und Adduktions- und Flexionsfähigkeit.

In einer Untergruppe von Mäusen werden die Forscher das Auftreten von Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke 24 Stunden nach dem distalen MCA-Verschluss untersuchen.

Zu diesem Zweck werden die Forscher am Ende der Operation 0,20 ml Evans Blue-Farbstoff (0,20 mg/ml) in die Schwanzvene der Maus injizieren, um den distalen Zweig der MCA zu verschließen. 24 Stunden nach der Injektion wird das Tier mit einer Überdosis Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (9 mg/kg) betäubt und dann mit 100 ml PBS perfundiert, um das Blut aus dem Gehirngewebe zu entfernen. Das Gehirn wird dann extrahiert und für eine Stunde in PFA 4% inkubiert. Dann wird das Gehirn mit einer Gehirnmatrix geschnitten, die ungefähr 15 Scheiben mit einer Dicke von 1 mm erzeugt.

In einer anderen Untergruppe von Mäusen werden die Forscher die Läsionsausdehnung und die Rekrutierung von Astrozyten 7 Tage nach Schlaganfallinduktion charakterisieren.

Zu diesem Zweck werden die Tiere mit einer Überdosis Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (9 mg/kg) anästhesiert und anschließend mit 4 % Paraformaldehyd transkardial perfundiert. Die Gehirne wurden unter Verwendung eines Vibratoms mit vibrierender Klinge (Leica, Deutschland) geschnitten, um 100 &mgr;m dicke Koronalschnitte für die Immunfärbung des neuronalen Markers NeuN (1:1000, Anti-NeuN-Huhn, Millipore, Deutschland) und Glia-Fibrillary-Acidic-Protein, GFAP, zu erhalten (1:1000, Anti-GFAP-Kaninchen, Abcam, Vereinigtes Königreich).

Die NeuN-Immunfärbung wird durchgeführt, um das Volumen der Schlaganfallläsion 7 Tage nach der Photothrombose zu quantifizieren. Das Schlagvolumen für jedes Tier wird berechnet, indem alle geschädigten Bereiche summiert und die Zahl mit der Schnittdicke und mit 4 (dem Abstandsfaktor) multipliziert wird. Bilder werden mit einem (Stemi 508, Carl Zeiss) aufgenommen. Das Gesamtvolumen in mm3 wird als Mittelwert ± Standardfehler aller analysierten Tiere angegeben.

Die Anzahl der Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP) positiven Neuronen wird mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop (Nikon Eclipse TE 300, Tokio, Japan) mit einem Nikon Plan EPO 60X Objektiv (NA 1.4, Ölimmersion Nikon, Tokio, Japan) analysiert. Die Ermittler werden unsere Untersuchung auf 4 interessierende Regionen konzentrieren, d. h. das Periinfarktgebiet (ischämische Grenzzone), eine Region in der ipsiläsionalen Hemisphäre entfernt vom Schlaganfallkern (ipsiläsionale Fernzone), eine Region kontralateral zum Periinfarktgebiet (kontralaterale ischämische Grenzzone) und eine Region in der gesunden Hemisphäre kontralateral zum ischämischen Kern (kontralateraler ischämischer Kern).