Akut iskæmisk slagtilfælde: Fra laboratorium til patientens SENG (STROKELABED)

Formålet med projektet er at evaluere sammenhængen mellem cirkulerende biomarkører relateret til forstyrrelse af blod-hjernebarriere med udvikling af cerebralt ødem, hæmoragisk transformation og udvidelsen af ​​det iskæmiske område undersøgt med moderne neuroimaging teknikker, for at identificere prædiktorer for reperfusionsskade i patienter, der gennemgår revaskulariseringsbehandlinger.

Parallelt med det kliniske studie vil efterforskerne undersøge mekanistiske aspekter på sammenhængen mellem neuronal degeneration og ændringen af ​​vaskulær permeabilitet. Til dette formål vil efterforskerne bruge en kombination af avancerede mikroskopiteknikker og vitale fluorescerende markeringer i en ny musemodel af iskæmisk slagtilfælde.

- Kliniske omgivelser: Dette er et monocentrisk retrospektivt observationsstudie af patienter med akut iskæmisk slagtilfælde, der har gennemgået revaskulariseringsbehandlinger (systemisk trombolyse, endovaskulær behandling) på slagtilfældeenheden på Careggi Universitetshospital fra 1. oktober 2015 til 31. maj 2020. Patientdata vil blive indtastet i et dedikeret register: demografiske og kliniske data samt hæmatokemiske og neuroimaging-parametre, der er omfattet af denne undersøgelse. Tilgængelige cirkulerende biomarkører og neuroimaging indsamlet ved hospitalsankomst og gentaget 24 timer efter interventioner vil blive inkluderet i analysen, såvel som det kliniske/funktionelle resultat vurderet 3 måneder efter slagtilfælde i henhold til den modificerede Rankin-skala ved besøg eller telefoninterview.

Laboratorieprotokol:

På vores universitetshospital tages der rutinemæssigt blodprøver af patienter med akut iskæmisk slagtilfælde før og 24 timer efter reperfusionsbehandling (enten intravenøs trombolyse eller endovaskulær trombektomi). Efterforskerne kunne hente blodprøver, der allerede er brugt til en tidligere undersøgelse (Piccardi et al. 2018) og stadig er korrekt opbevaret og tilgængelig i vores biologiske bank: Blod opsamles i rør både med antikoagulant og uden antikoagulant. Rørene centrifugeres derefter ved stuetemperatur ved 1500 x g i 15 minutter, og supernatanten opbevares i alikvoter ved -80°C.

Neuroimaging protokol:

Baseline neuroimaging vurdering, herunder non-contrast CT (NCCT), CT-Angiografi (CTA) og CT-Perfusion (CTP) er blevet udført før akutte indgreb, når det er indiceret i henhold til de retningslinjer, der var gældende på behandlingstidspunktet. En 24 timers opfølgning NCCT er blevet udført hos alle patienter.

Efter 24 timer, i henhold til internationale retningslinjer, gennemgår alle patienter en kontrolhoved-CT eller hjerne-MR for at bestemme tilstedeværelsen af ​​hæmoragisk transformation, cerebralt ødem og volumenet af det iskæmiske område. Genlæsningen af ​​de allerede erhvervede billeder vil blive udført i DICOM-format. De indsamlede data vil blive registreret i en særlig afdeling af det elektroniske register.

To ekspertneurologer vil separat evaluere hver patients baseline og 24-timers CT og registrere tilstedeværelsen af ​​cerebralt ødem klassificeret i henhold til SITS-ISTR kriterierne: COED1 = fokal hjernehævelse op til en tredjedel af halvkuglen, COED2 = fokal hjernehævelse større end en tredjedel af hemisfæren, COED3 = hjernehævelse med midtlinjeforskydning, INGEN = fravær af cerebralt ødem. De to uafhængige neurologer vil også lave en manuel kortlægning ("maske") af den iskæmiske læsion, der er synlig på 24-timers CT-scanningen. Eventuelle uoverensstemmelser vil blive løst af en erfaren neuroradiolog. Til denne proces vil FSLeyes blive brugt, en software inkluderet i FSL-softwaren (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), som giver mulighed for at generere en tredimensionel læsionsmaske for hver patient, der dækker infarktvævet på alle CT-sektioner. Tidligere iskæmiske udfald (allerede til stede på baseline CT) vil ikke blive inkluderet i maskerne.

Anatomisk forvrængning (AD) vil blive vurderet ved at sammenligne baseline CT med 24-timers CT. De nødvendige trin for at opnå denne måling omfatter afgrænsning af den iskæmiske læsion, der er synlig efter 24 timer ved hjælp af en "maske" (beskrevet før) og registrering, en procedure, der gør det muligt nøjagtigt at sammenligne forskellige billeder af hjernen, selv på forskellige tidspunkter og individer. AD kan beregnes ved at sammenligne de to mulige registreringstilgange og især ved at kvantificere forskellen mellem læsionsmaskerne behandlet gennem lineær og ikke-lineær registrering i henhold til metoden beskrevet af Harston et al. i 2018. Al billedbehandling og analyse vil blive udført ved hjælp af FSL-software (FMRIB Software Library v6.0, skabt af Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), en gratis adgangssoftware udviklet af en forskningsgruppe fra University of Oxford.

3 måneders udfald: Alle patienter behandlet med systemisk trombolyse eller endovaskulær behandling følges op 3 måneder efter den iktale hændelse med en evaluering af det klinisk-funktionelle udfald i henhold til den modificerede Rankin-skala, direkte i ambulatoriet eller ved telefoninterview .

Disse data skal derfor indhentes fra ambulante rapporter. Kun hvis data mangler, vil der blive gennemført et telefoninterview.

- Prækliniske omgivelser: Den prækliniske forskningsgruppe vil karakterisere en ny musemodel for okklusion/reperfusion af MCA. Alle procedurer, der involverer mus, vil blive udført i overensstemmelse med reglerne fra det italienske sundhedsministeriums autorisation nr. 723/2019.

Mus vil blive bedøvet med ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg). Kropstemperaturen holdes på 37°C med en varmepude. Mus vil blive placeret på en operationspude, liggende på den ene side. Musehårene mellem øjet og øret vil blive fjernet og derefter renses huden med betadin og ethanol. Derefter påføres lokalbedøvende lidokain 2 %. Huden over pladeknoglen vil blive skåret over med et blad, musklen vil blive løsrevet fra kraniet og forsigtigt presset ned for at blotlægge knoglen.

Derefter vil en tandboremaskine (Silfradent, Italia) blive brugt til at skabe en lille kraniotomi for at blotlægge den distale gren af ​​den midterste cerebrale arterie. Når flapknoglen er fjernet, vil et lysfølsomt farvestof, Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml opløsning i saltvandsopløsning; Sigma Aldrich, USA) blive injiceret intraperitonealt. Fem minutter efter injektionen vil en 532 nm laser (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Tyskland) blive fokuseret opstrøms for MCA-forgreningen i femogtyve minutter for at inducere dannelsen af ​​en stabil koagel. 30 minutter efter okklusionen af ​​den distale gren af ​​MCA, for at fremme afbrydelsen af ​​koagulationen og den deraf følgende rekanalisering af blodkarret, vil efterforskerne belyse det samme område med en 365 nm UV LED (High-Power LED SOLIS) -365C, Thorlabs, Tyskland) i femten minutter. Efter UV-bestrålingsperioden rekanaliserede den distale gren af ​​MCA-resultatet. Ved afslutningen af ​​proceduren vil musklen blive udskiftet over knoglen og huden syet.

I løbet af det eksperimentelle tidsvindue vil efterforskerne karakterisere den funktionelle svækkelse induceret af okklusion af den distale gren af ​​MCA med og uden rekanalisering.

Til dette formål vil efterforskerne bruge neurodeficit-score, der modificerer protokollen anvendt af Balbi og samarbejdspartnere i 2019, baseret på en standardiseret kvalitativ vurdering til måling af graden af ​​motorisk svækkelse (Bederson et al. 1986) ved at anvende et panel af fem motoriske tests til at evaluere styrke, balance og adduktions- og fleksionsevne.

I en undergruppe af mus vil efterforskerne undersøge fremkomsten af ​​blod-hjerne-barriereændringer 24 timer efter distal MCA-okklusion.

Til dette formål vil efterforskerne injicere 0,20 ml Evans Blue-farvestof (0,20 mg/ml) i musehalevenen ved slutningen af ​​operationen for at okkludere den distale gren af ​​MCA. 24 timer efter injektionen vil dyret blive bedøvet med en overdosis af ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg) og derefter perfunderet med 100 ml PBS for at fjerne blodet fra hjernevævet. Hjernen vil derefter blive ekstraheret og inkuberet i PFA 4% i en time. Derefter vil hjernen blive sektioneret med en hjernematrix, der producerer cirka 15 skiver 1 mm tykke.

I en anden undergruppe af mus vil efterforskerne karakterisere læsionsforlængelse og rekruttering af astrocytter 7 dage efter induktion af slagtilfælde.

Til dette formål vil dyr blive bedøvet med en overdosis af ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg) og derefter transkardialt perfunderet med 4% paraformaldehyd. Hjerner blev skåret ved hjælp af en vibrator med vibrerende blade (Leica, Tyskland) for at opnå 100 µm tykke koronale sektioner til immunfarvning af Neuronal markør, NeuN (1:1000, anti-NeuN kylling, Millipore, Tyskland) og Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP (1:1000, anti-GFAP-kanin, Abcam, Storbritannien).

NeuN immunfarvning vil blive udført for at kvantificere slagtilfælde læsionsvolumen 7 dage efter fototrombose. Slagvolumenet for hvert dyr vil blive beregnet ved at summere alle beskadigede områder og gange antallet med snittykkelse og med 4 (afstandsfaktoren). Billeder vil blive erhvervet med en (Stemi 508, Carl Zeiss). Det totale volumen i mm3 vil blive angivet som middel ± standardfejl for alle analyserede dyr.

Antallet af Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP) positive neuroner vil blive analyseret ved hjælp af et konfokalt fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japan) med et Nikon Plan EPO 60X objektiv (NA 1.4, olienedsænkning Nikon, Tokyo, Japan). Efterforskerne vil fokusere vores undersøgelse på 4 områder af interesse, dvs. peri-infarktområdet (iskæmisk grænsezone), en region i den ipsilesionale halvkugle fjernt fra slagtilfældekernen (ipsilesional remote zone), en region kontralateral til peri-infarktområdet (kontralateral iskæmisk grænsezone), og en region i den raske hemisfære kontralateral til den iskæmiske kerne (kontralateral iskæmisk kerne).