Ictus ischemico acuto: dal laboratorio al letto del paziente (STROKELABED)

Lo scopo del progetto è valutare la correlazione dei biomarcatori circolanti correlati alla rottura della barriera ematoencefalica con lo sviluppo di edema cerebrale, trasformazione emorragica e l'estensione dell'area ischemica indagata con le moderne tecniche di neuroimaging, al fine di identificare predittori di danno da riperfusione in pazienti sottoposti a terapie di rivascolarizzazione.

Parallelamente allo studio clinico, i ricercatori indagheranno aspetti meccanicistici sulla correlazione tra degenerazione neuronale e alterazione della permeabilità vascolare. A tal fine, i ricercatori utilizzeranno una combinazione di tecniche di microscopia avanzate e marcature fluorescenti vitali in un nuovo modello murino di ictus ischemico.

- Ambito clinico: si tratta di uno studio osservazionale retrospettivo monocentrico su pazienti con ictus ischemico acuto sottoposti a terapie di rivascolarizzazione (trombolisi sistemica, trattamento endovascolare) presso la Stroke Unit dell'Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi dal 1 ottobre 2015 al 31 maggio 2020. I dati dei pazienti saranno inseriti in un registro dedicato: dati demografici e clinici, nonché parametri ematochimici e di neuroimaging oggetto di questo studio. Saranno inclusi nell'analisi i biomarcatori circolanti disponibili e le neuroimmagini raccolte all'arrivo in ospedale e ripetute 24 ore dopo gli interventi, nonché l'esito clinico/funzionale valutato 3 mesi dopo l'ictus secondo la scala Rankin modificata mediante visita o intervista telefonica.

Protocollo di laboratorio:

Nel nostro ospedale universitario, nei pazienti con ictus ischemico acuto i campioni di sangue vengono raccolti di routine prima e 24 ore dopo il trattamento di riperfusione (trombolisi endovenosa o trombectomia endovascolare). I ricercatori hanno potuto recuperare campioni di sangue già utilizzati per uno studio precedente (Piccardi et al. 2018) e ancora correttamente conservati e disponibili nella nostra banca biologica: il sangue viene raccolto in provette sia con anticoagulante che senza anticoagulante. Le provette vengono quindi centrifugate a temperatura ambiente a 1500 x g per 15 minuti e il surnatante viene conservato in aliquote a -80° C.

Protocollo di neuroimmagini:

La valutazione di base di neuroimaging, inclusa la TC senza contrasto (NCCT), l'angiografia TC (CTA) e la perfusione TC (CTP) è stata eseguita prima degli interventi in acuto quando indicato secondo le linee guida in vigore al momento del trattamento. In tutti i pazienti è stato eseguito un NCCT di follow-up di 24 ore.

Dopo 24 ore, come da linee guida internazionali, tutti i pazienti vengono sottoposti a TC di controllo o RM cerebrale per determinare la presenza di trasformazione emorragica, edema cerebrale e il volume dell'area ischemica. La rilettura delle immagini già acquisite sarà effettuata su formato DICOM. I dati raccolti saranno registrati in un'apposita sezione del registro elettronico.

Due esperti neurologi valuteranno separatamente il basale e la TC delle 24 ore di ciascun paziente e registreranno la presenza di edema cerebrale classificato secondo i criteri SITS-ISTR: COED1 = tumefazione cerebrale focale fino a un terzo dell'emisfero, COED2 = tumefazione cerebrale focale maggiore di un terzo dell'emisfero, COED3 = edema cerebrale con spostamento della linea mediana, NONE = assenza di edema cerebrale. I due neurologi indipendenti creeranno anche una mappatura manuale ("maschera") della lesione ischemica visibile alla TAC delle 24 ore. Eventuali discrepanze saranno risolte da un neuroradiologo esperto. Per questo processo verrà utilizzato FSLeyes, un software incluso nel software FSL (FMRIB Software Library v6.0, creato da Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) che offre la possibilità di generare una maschera di lesione tridimensionale per ogni paziente, coprendo il tessuto infartuale su tutte le sezioni CT. Precedenti esiti ischemici (già presenti alla TC basale) non saranno inclusi nelle mascherine.

La distorsione anatomica (AD) sarà valutata confrontando la TC basale con la TC delle 24 ore. I passaggi necessari per ottenere questa misurazione comprendono la delineazione della lesione ischemica visibile a 24 ore mediante una "maschera" (descritta in precedenza) e la registrazione, una procedura che consente di confrontare accuratamente diverse immagini del cervello, anche in tempi e individui diversi. La AD può essere calcolata confrontando i due possibili approcci di registrazione ed in particolare quantificando la differenza tra le maschere di lesione processate tramite registrazione Lineare e Non-Lineare secondo il metodo descritto da Harston et al. nel 2018. Tutta l'elaborazione e l'analisi delle immagini saranno eseguite utilizzando il software FSL (FMRIB Software Library v6.0, Creato dall'Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), un software ad accesso libero sviluppato da un gruppo di ricerca dell'Università di Oxford.

Esito a 3 mesi: Tutti i pazienti trattati con trombolisi sistemica o trattamento endovascolare vengono seguiti a 3 mesi dall'evento ictale con una valutazione dell'esito clinico-funzionale secondo la Rankin Scale modificata, direttamente in ambulatorio o tramite intervista telefonica .

Tali dati devono quindi essere acquisiti da referti ambulatoriali. Solo in caso di mancanza dei dati verrà effettuata un'intervista telefonica.

- Contesto preclinico: il gruppo di ricerca preclinico caratterizzerà un nuovo modello murino di occlusione/riperfusione della MCA. Tutte le procedure che coinvolgono i topi saranno eseguite in conformità con le norme dell'autorizzazione del Ministero della Salute italiano n. 723/2019.

I topi saranno anestetizzati con ketamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg). La temperatura corporea sarà mantenuta a 37°C con un termoforo. I topi saranno posizionati su un tampone chirurgico, sdraiati su un lato. I peli di topo tra l'occhio e l'orecchio verranno rimossi e quindi la pelle verrà pulita con betadine ed etanolo. Quindi, verrà applicato l'anestetico locale lidocaina 2%. La pelle sopra l'osso squamoso verrà tagliata con una lama, il muscolo verrà staccato dal cranio e spinto delicatamente verso il basso per esporre l'osso.

Quindi, un trapano dentale (Silfradent, Italia) verrà utilizzato per creare una piccola craniotomia per esporre il ramo distale dell'arteria cerebrale media. Una volta rimosso il lembo osseo, verrà iniettato per via intraperitoneale un colorante fotosensibile, Rosebengal (0.2 ml, 10 mg/ml soluzione in soluzione salina; Sigma Aldrich, USA). Cinque minuti dopo l'iniezione, un laser a 532 nm (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Germania) sarà focalizzato a monte della ramificazione dell'MCA per venticinque minuti per indurre la formazione di un coagulo stabile. Trenta minuti dopo l'occlusione del ramo distale dell'MCA, al fine di favorire la rottura del coagulo e la conseguente ricanalizzazione del vaso sanguigno, gli investigatori illumineranno la stessa regione con un LED UV da 365 nm (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Germania) per quindici minuti. Dopo il periodo di irradiazione UV, il ramo distale del risultato MCA è stato ricanalizzato. Al termine della procedura, il muscolo verrà riposizionato sopra l'osso e la pelle suturata.

Durante la finestra temporale sperimentale gli investigatori caratterizzeranno la compromissione funzionale indotta dall'occlusione del ramo distale dell'MCA con e senza ricanalizzazione.

A questo scopo i ricercatori utilizzeranno il neurodeficit score modificando il protocollo applicato da Balbi e collaboratori nel 2019, basato su una valutazione qualitativa standardizzata per misurare il grado di compromissione motoria (Bederson et al. 1986) impiegando un panel di cinque test motori per valutare forza, equilibrio e capacità di adduzione e flessione.

In un sottogruppo di topi gli investigatori studieranno l'emergere di alterazioni della barriera emato-encefalica 24 ore dopo l'occlusione distale dell'MCA.

A tal fine, gli investigatori inietteranno nella vena della coda del topo 0,20 mL di colorante Evans Blue (0,20 mg/mL), al termine dell'intervento chirurgico per occludere il ramo distale dell'MCA. 24 ore dopo l'iniezione l'animale sarà anestetizzato con una dose eccessiva di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg) e poi perfuso con 100 mL di PBS per rimuovere il sangue dal tessuto cerebrale. Il cervello verrà quindi estratto e incubato in PFA 4% per un'ora. Quindi il cervello sarà sezionato con una matrice cerebrale che produce circa 15 fette spesse 1 mm.

In un altro sottogruppo di topi i ricercatori caratterizzeranno l'estensione della lesione e il reclutamento di astrociti 7 giorni dopo l'induzione dell'ictus.

A questo scopo, gli animali saranno anestetizzati con una dose eccessiva di ketamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg) e poi perfusi per via transcardiaca con paraformaldeide al 4%. I cervelli sono stati tagliati utilizzando un vibratomo a lama vibrante (Leica, Germania) per ottenere sezioni coronali spesse 100 μm per l'immunocolorazione del marcatore neuronale, NeuN (1: 1000, pollo anti-NeuN, Millipore, Germania) e proteina acida fibrillare gliale, GFAP (1:1000, coniglio anti-GFAP, Abcam, Regno Unito).

L'immunocolorazione NeuN sarà eseguita per quantificare il volume della lesione da ictus 7 giorni dopo la fototrombosi. Il volume della corsa per ogni animale sarà calcolato sommando tutte le aree danneggiate e moltiplicando il numero per lo spessore della sezione e per 4 (il fattore di spaziatura). Le immagini verranno acquisite con uno (Stemi 508, Carl Zeiss). Il volume totale in mm3 sarà dato come media ± errore standard di tutti gli animali analizzati.

Il numero di neuroni positivi per glial fibrillary acid protein (GFAP) sarà analizzato utilizzando un microscopio a fluorescenza confocale (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Giappone) con un obiettivo Nikon Plan EPO 60X (NA 1.4, immersione in olio Nikon, Tokyo, Giappone). Gli investigatori concentreranno la nostra indagine su 4 regioni di interesse, vale a dire l'area peri-infartuale (zona di confine ischemico), una regione nell'emisfero ipsilesionale distante dal nucleo dell'ictus (zona remota ipsilesionale), una regione controlaterale all'area peri-infartuale (zona di confine ischemico controlaterale) e una regione nell'emisfero sano controlaterale al nucleo ischemico (nucleo ischemico controlaterale).