Akuutti iskeeminen aivohalvaus: Laboratoriosta potilaan sänkyyn (STROKELABED)

Projektin tarkoituksena on arvioida veri-aivoesteen häiriöihin liittyvien kiertävien biomarkkerien korrelaatiota aivoturvotuksen, verenvuotomuutoksen ja iskeemisen alueen laajenemisen kanssa nykyaikaisilla neurokuvantamistekniikoilla tutkitun reperfuusiovaurion ennustajien tunnistamiseksi. potilailla, jotka saavat revaskularisaatiohoitoja.

Samanaikaisesti kliinisen tutkimuksen kanssa tutkijat selvittävät mekanistisia näkökohtia hermosolujen rappeutumisen ja verisuonten läpäisevyyden muutosten välisestä korrelaatiosta. Tätä varten tutkijat käyttävät kehittyneiden mikroskopiatekniikoiden ja elintärkeiden fluoresoivien merkintöjen yhdistelmää iskeemisen aivohalvauksen uudessa hiirimallissa.

- Kliininen ympäristö: Tämä on yksikeskinen retrospektiivinen havainnointitutkimus potilaista, joilla on akuutti iskeeminen aivohalvaus, joille on tehty revaskularisaatiohoitoja (systeeminen trombolyysi, endovaskulaarinen hoito) Careggin yliopistollisen sairaalan aivohalvausosastolla 1.10.2015-31.5.2020. Potilaiden tiedot tallennetaan erityiseen rekisteriin: demografiset ja kliiniset tiedot sekä hematokemialliset ja hermokuvausparametrit, jotka tämä tutkimus kattaa. Käytettävissä olevat verenkierrossa olevat biomarkkerit ja neurokuvaus, jotka on kerätty sairaalaan saapuessa ja toistettu 24 tuntia interventioiden jälkeen, sekä kliininen/toiminnallinen tulos, joka arvioidaan 3 kuukautta aivohalvauksen jälkeen modifioidun Rankin-asteikon mukaan käynnillä tai puhelinhaastattelulla.

Laboratorioprotokolla:

Yliopistosairaalassamme akuuteilla iskeemisillä aivohalvauspotilailla verinäytteitä kerätään rutiininomaisesti ennen reperfuusiohoitoa ja 24 tuntia sen jälkeen (joko suonensisäinen trombolyysi tai endovaskulaarinen trombektomia). Tutkijat pystyivät hakemaan verinäytteitä, joita oli jo käytetty aikaisemmassa tutkimuksessa (Piccardi ym. 2018) ja vielä oikein säilytettyjä ja saatavilla biologisessa pankissamme: veri kerätään putkiin sekä antikoagulantilla että ilman antikoagulanttia. Sitten putkia sentrifugoidaan huoneenlämpötilassa 1500 x g:ssä 15 minuuttia, ja supernatanttia säilytetään erissä -80 °C:ssa.

Neurokuvantamisprotokolla:

Neurokuvantamisen perusarviointi, mukaan lukien non-contrast CT (NCCT), CT-angiografia (CTA) ja CT-perfuusio (CTP), on tehty ennen akuutteja interventioita, kun se on aiheellista hoidon aikana voimassa olevien ohjeiden mukaisesti. Kaikille potilaille on tehty 24 tunnin seuranta NCCT.

24 tunnin kuluttua kaikille potilaille tehdään kansainvälisten ohjeiden mukaisesti kontrollipään CT tai aivojen MRI verenvuotomuutoksen, aivoturvotuksen ja iskeemisen alueen tilavuuden määrittämiseksi. Jo hankittujen kuvien uudelleenluku suoritetaan DICOM-muodossa. Kerätyt tiedot tallennetaan sähköisen rekisterin erityiseen osioon.

Kaksi asiantuntijaneurologia arvioi erikseen kunkin potilaan lähtötilanteen ja 24 tunnin TT:n ja kirjaa aivoturvotuksen esiintymisen, jotka luokitellaan SITS-ISTR-kriteerien mukaan: COED1 = fokaalinen aivojen turvotus enintään kolmannekseen aivopuoliskosta, COED2 = fokaalinen aivojen turvotus, joka on suurempi kuin kolmasosa pallonpuoliskosta, COED3 = aivojen turvotus ja keskiviivan siirtymä, EI MITÄÄN = aivoturvotuksen puuttuminen. Kaksi riippumatonta neurologia luovat myös manuaalisen kartoituksen ("maskin") iskeemisestä vauriosta, joka näkyy 24 tunnin CT-skannauksessa. Kokenut neuroradiologi ratkaisee mahdolliset ristiriidat. Tässä prosessissa käytetään FSLeyes, FSL-ohjelmistoon sisältyvää ohjelmistoa (FMRIB Software Library v6.0, luonut Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), joka tarjoaa mahdollisuuden luoda kolmiulotteinen leesiomaski kullekin. potilas, joka peittää infarktin kudoksen kaikilla CT-leikkeillä. Aiempia iskeemisiä tuloksia (jotka ovat jo lähtötilanteen TT:ssä) ei sisällytetä maskeihin.

Anatominen vääristymä (AD) arvioidaan vertaamalla peruskuvaa 24 tunnin TT:hen. Tämän mittauksen saamiseksi vaadittavat vaiheet sisältävät 24 tunnin kuluttua näkyvän iskeemisen leesion rajaamisen "naamion" avulla (kuvattu aiemmin) ja rekisteröinnin, menettelyn, joka mahdollistaa aivojen eri kuvien tarkan vertaamisen jopa eri aikoina ja eri henkilöillä. AD voidaan laskea vertaamalla kahta mahdollista rekisteröintitapaa ja erityisesti kvantifioimalla lineaarisella ja ei-lineaarisella rekisteröinnillä käsiteltyjen vauriomaskien välinen ero Harston et ai. kuvaaman menetelmän mukaisesti. vuonna 2018. Kaikki kuvankäsittely ja analyysi suoritetaan käyttämällä FSL-ohjelmistoa (FMRIB Software Library v6.0, Created by Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), joka on Oxfordin yliopiston tutkimusryhmän kehittämä ilmainen ohjelmisto.

3 kuukauden tulos: Kaikkia potilaita, joita hoidetaan systeemisellä trombolyysillä tai endovaskulaarisella hoidolla, seurataan 3 kuukautta iktaalisen tapahtuman jälkeen kliinis-toiminnallisen lopputuloksen arvioinnilla muokatun Rankin-asteikon mukaisesti suoraan poliklinikalla tai puhelinhaastattelulla. .

Nämä tiedot on siksi hankittava avohoitoraporteista. Vain jos tiedot puuttuvat, suoritetaan puhelinhaastattelu.

- Prekliiniset olosuhteet: Prekliininen tutkimusryhmä luonnehtii uutta hiirimallia MCA:n okkluusio/reperfuusio. Kaikki hiiriä koskevat toimenpiteet suoritetaan Italian terveysministeriön luvan nro n. 723/2019.

Hiiret nukutetaan ketamiinilla (50 mg/kg) ja ksylatsiinilla (9 mg/kg). Kehon lämpötila pidetään 37 °C:ssa lämmitystyynyn avulla. Hiiret asetetaan leikkausalustalle, makaamaan toisella puolella. Silmän ja korvan väliset hiiren karvat poistetaan ja iho puhdistetaan betadiinilla ja etanolilla. Sitten levitetään paikallispuudutetta 2 % lidokaiinia. Lihaluun yli oleva iho leikataan terällä, lihas irrotetaan kallosta ja työnnetään varovasti alas luun paljastamiseksi.

Sitten hammasporalla (Silfradent, Italia) tehdään pieni kraniotomia keskimmäisen aivovaltimon distaalisen haaran paljastamiseksi. Kun läppäluu on poistettu, valoherkkä väriaine Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml liuos suolaliuoksessa; Sigma Aldrich, USA) ruiskutetaan vatsaonteloon. Viisi minuuttia injektion jälkeen 532 nm:n laser (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Saksa) fokusoidaan MCA-haaroituksesta vastavirtaan 25 minuutin ajan stabiilin hyytymän muodostumisen aikaansaamiseksi. Kolmekymmentä minuuttia MCA:n distaalisen haaran tukkeutumisen jälkeen tutkijat valaisevat saman alueen 365 nm:n UV-LED:llä (High-Power LED SOLIS). -365C, Thorlabs, Saksa) 15 minuuttia. UV-säteilytysjakson jälkeen MCA-tuloksen distaalinen haara kanaalisoitui uudelleen. Toimenpiteen lopussa lihas korvataan luun päällä ja iho ommellaan.

Kokeellisen aikaikkunan aikana tutkijat karakterisoivat MCA:n distaalisen haaran tukkeuman aiheuttamaa toiminnallista heikentymistä uudelleenkanavalla ja ilman.

Tätä tarkoitusta varten tutkijat käyttävät neurodeficit-pisteitä, jotka muuttavat Balbin ja yhteistyökumppaneiden vuonna 2019 soveltamaa protokollaa, joka perustuu standardoituun kvalitatiiviseen arvioon motorisen vajaatoiminnan asteen mittaamiseksi (Bederson et al. 1986), jossa käytetään viiden motorisen testin paneelia arvioinnissa. voimaa, tasapainoa sekä adduktio- ja taivutuskykyä.

Eräässä hiirten alaryhmässä tutkijat tutkivat veri-aivoesteen muutosten ilmaantumista 24 tuntia distaalisen MCA-tukoksen jälkeen.

Tätä tarkoitusta varten tutkijat ruiskuttavat hiiren häntälaskimoon 0,20 ml Evans Blue -väriä (0,20 mg/ml) leikkauksen lopussa MCA:n distaalisen haaran tukkimiseksi. 24 tuntia injektion jälkeen eläin nukutetaan yliannoksella ketamiinia (50 mg/kg) ja ksylatsiinia (9 mg/kg) ja perfusoidaan sitten 100 ml:lla PBS:ää veren poistamiseksi aivokudoksesta. Sitten aivot uutetaan ja niitä inkuboidaan 4 % PFA:ssa yhden tunnin ajan. Sitten aivot leikataan aivomatriisilla, joka tuottaa noin 15 viipaletta, joiden paksuus on 1 mm.

Toisessa hiirten alaryhmässä tutkijat karakterisoivat leesion laajenemisen ja astrosyyttien kerääntymisen 7 päivää aivohalvauksen induktion jälkeen.

Tätä tarkoitusta varten eläimet nukutetaan yliannoksella ketamiinia (50 mg/kg) ja ksylatsiinia (9 mg/kg) ja perfusoidaan sitten transkardiaalisesti 4 % paraformaldehydillä. Aivot leikattiin käyttämällä värähteleväterävibratomia (Leica, Saksa), jotta saatiin 100 µm:n paksuiset koronaleikkeet neuronaalisen markkerin, NeuN:n (1:1000, anti-NeuN-kana, Millipore, Saksa) ja gliafibrillaarisen happaman proteiinin, GFAP, immunovärjäystä varten. (1:1000, anti-GFAP kani, Abcam, Yhdistynyt kuningaskunta).

NeuN-immunovärjäys suoritetaan aivohalvausleesion tilavuuden kvantifioimiseksi 7 päivää valotromboosin jälkeen. Kunkin eläimen vetotilavuus lasketaan laskemalla yhteen kaikki vaurioituneet alueet ja kertomalla luku osan paksuudella ja neljällä (välikerroin). Kuvat hankitaan (Stemi 508, Carl Zeiss). Kokonaistilavuus millimetreinä ilmoitetaan kaikkien analysoitujen eläinten keskiarvona ± keskivirhe.

Glial fibrillary Acid Protein (GFAP) -positiivisten neuronien lukumäärä analysoidaan käyttämällä konfokaalista fluoresenssimikroskooppia (Nikon Eclipse TE 300, Tokio, Japani) ja Nikon Plan EPO 60X -objektiivia (NA 1.4, öljyimmersio Nikon, Tokio, Japani). Tutkijat keskittävät tutkimuksemme neljään kiinnostavaan alueeseen, eli peri-infarktialueeseen (iskeeminen rajavyöhyke), ipsilesionaalisen aivopuoliskon alueeseen, joka on kaukana aivohalvauksen ytimestä (ipsilesionaalinen kaukovyöhyke), alueelle, joka on vastakkainen periinfarktialueen kanssa (kontralateraalinen iskeeminen rajavyöhyke) ja terveen pallonpuoliskon alue, joka on vastakkainen iskeemisen ytimen kanssa (kontralateraalinen iskeeminen ydin).