Acute ischemische beroerte: van het laboratorium tot het bed van de patiënt (STROKELABED)

Het doel van het project is het evalueren van de correlatie van circulerende biomarkers gerelateerd aan verstoring van de bloed-hersenbarrière met de ontwikkeling van hersenoedeem, hemorragische transformatie en de uitbreiding van het ischemisch gebied onderzocht met moderne neuroimaging technieken, om voorspellers van reperfusieschade te identificeren in patiënten die revascularisatietherapieën ondergaan.

Parallel aan de klinische studie zullen de onderzoekers mechanistische aspecten van de correlatie tussen neuronale degeneratie en de verandering van vasculaire permeabiliteit onderzoeken. Daartoe zullen de onderzoekers een combinatie van geavanceerde microscopietechnieken en vitale fluorescerende markeringen gebruiken in een nieuw muismodel van ischemische beroerte.

- Klinische setting: dit is een monocentrische retrospectieve observationele studie van patiënten met een acute ischemische beroerte die van 1 oktober 2015 tot 31 mei 2020 revascularisatietherapieën (systemische trombolyse, endovasculaire behandeling) hebben ondergaan op de Stroke Unit van het Careggi Universitair Ziekenhuis. Patiëntgegevens zullen worden ingevoerd in een speciaal register: demografische en klinische gegevens, evenals hematochemische en neuroimaging-parameters die in deze studie aan de orde komen. Beschikbare circulerende biomarkers en neuroimaging verzameld bij aankomst in het ziekenhuis en herhaald 24 uur na interventies zullen in de analyse worden opgenomen, evenals de klinische / functionele uitkomst beoordeeld 3 maanden na een beroerte volgens de aangepaste Rankin-schaal door bezoek of telefonisch interview.

Laboratoriumprotocol:

In ons academisch ziekenhuis worden routinematig bloedmonsters afgenomen bij patiënten met een acute ischemische beroerte voor en 24 uur na reperfusiebehandeling (hetzij intraveneuze trombolyse of endovasculaire trombectomie). De onderzoekers konden bloedmonsters terughalen die al gebruikt waren voor een eerdere studie (Piccardi et al. 2018) en die nog steeds correct opgeslagen en beschikbaar zijn in onze biologische bank: bloed wordt opgevangen in tubes met zowel antistollingsmiddel als zonder antistollingsmiddel. Buizen worden vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bij 1500 x g gecentrifugeerd en het supernatant wordt in aliquots bij -80°C bewaard.

Neuroimaging-protocol:

Baseline neuroimaging-evaluatie, inclusief Non-Contrast CT (NCCT), CT-Angiography (CTA) en CT-Perfusion (CTP) is uitgevoerd vóór acute interventies indien geïndiceerd volgens richtlijnen die gelden op het moment van de behandeling. Bij alle patiënten is een 24-uurs follow-up NCCT uitgevoerd.

Volgens internationale richtlijnen ondergaan alle patiënten na 24 uur een controlekop-CT of hersen-MRI om de aanwezigheid van hemorragische transformatie, hersenoedeem en het volume van het ischemische gebied te bepalen. Het herlezen van de reeds verkregen beelden zal worden uitgevoerd in DICOM-formaat. De verzamelde gegevens worden vastgelegd in een speciaal gedeelte van het elektronisch register.

Twee deskundige neurologen evalueren afzonderlijk de basislijn en 24-uurs CT van elke patiënt en registreren de aanwezigheid van hersenoedeem geclassificeerd volgens de SITS-ISTR-criteria: COED1 = focale hersenzwelling tot een derde van de hemisfeer, COED2 = focale hersenzwelling groter dan een derde van het halfrond, COED3 = hersenzwelling met middellijnverschuiving, GEEN = afwezigheid van hersenoedeem. De twee onafhankelijke neurologen zullen ook een handmatige mapping ("masker") maken van de ischemische laesie die zichtbaar is op de 24-uurs CT-scan. Eventuele afwijkingen worden opgelost door een ervaren neuroradioloog. Voor dit proces zal FSLeyes worden gebruikt, een software die is opgenomen in de FSL-software (FMRIB Software Library v6.0, gemaakt door de Analysis Group, FMRIB, Oxford, VK) die de mogelijkheid biedt om een ​​driedimensionaal laesiemasker te genereren voor elke patiënt, die het infarctweefsel op alle CT-secties bedekt. Eerdere ischemische uitkomsten (reeds aanwezig op baseline CT) worden niet opgenomen in de maskers.

Anatomische vervorming (AD) zal worden beoordeeld door de baseline CT te vergelijken met de 24-uurs CT. De stappen die nodig zijn om deze meting te verkrijgen, omvatten het afbakenen van de ischemische laesie die na 24 uur zichtbaar is met behulp van een "masker" (eerder beschreven) en registratie, een procedure die het mogelijk maakt om verschillende beelden van de hersenen nauwkeurig te vergelijken, zelfs op verschillende tijdstippen en individuen. AD kan worden berekend door de twee mogelijke registratiebenaderingen te vergelijken en in het bijzonder door het verschil te kwantificeren tussen de laesiemaskers verwerkt via lineaire en niet-lineaire registratie volgens de methode beschreven door Harston et al. in 2018. Alle beeldverwerking en -analyse zal worden uitgevoerd met behulp van FSL-software (FMRIB Software Library v6.0, gemaakt door de Analysis Group, FMRIB, Oxford, VK), gratis toegankelijke software ontwikkeld door een onderzoeksgroep van de Universiteit van Oxford.

Uitkomst na 3 maanden: Alle patiënten behandeld met systemische trombolyse of endovasculaire behandeling worden 3 maanden na het ictale voorval gevolgd met een evaluatie van de klinisch-functionele uitkomst volgens de gemodificeerde Rankin-schaal, rechtstreeks in de polikliniek of via een telefonisch interview .

Deze gegevens moeten dus worden verkregen uit poliklinische rapportages. Alleen als de gegevens ontbreken, vindt een telefonisch interview plaats.

- Preklinische setting: De preklinische onderzoeksgroep zal een nieuw muismodel van occlusie/reperfusie van de MCA karakteriseren. Alle procedures waarbij muizen betrokken zijn, worden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid, autorisatie n. 723/2019.

Muizen worden verdoofd met ketamine (50 mg/kg) en xylazine (9 mg/kg). De lichaamstemperatuur wordt op 37°C gehouden met een verwarmingskussen. Muizen worden op een operatiekussen geplaatst, liggend aan één kant. De muizenharen tussen het oog en het oor worden verwijderd en vervolgens wordt de huid gereinigd met betadine en ethanol. Vervolgens wordt plaatselijk verdovingsmiddel lidocaïne 2% aangebracht. De huid boven het squamosale bot wordt met een mes doorgesneden, de spier wordt losgemaakt van de schedel en voorzichtig naar beneden geduwd om het bot bloot te leggen.

Vervolgens zal een tandheelkundige boor (Silfradent, Italia) worden gebruikt om een ​​kleine craniotomie te maken om de distale tak van de middelste hersenslagader bloot te leggen. Nadat het flapbot is verwijderd, wordt een lichtgevoelige kleurstof, Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml oplossing in zoutoplossing; Sigma Aldrich, VS) intraperitoneaal geïnjecteerd. Vijf minuten na de injectie zal een 532 nm laser (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Duitsland) gedurende vijfentwintig minuten stroomopwaarts van de MCA-vertakking worden gefocusseerd om de vorming van een stabiel stolsel te induceren. Dertig minuten na de occlusie van de distale tak van de MCA zullen de onderzoekers, om de verstoring van het stolsel en de daaruit voortvloeiende rekanalisatie van het bloedvat te bevorderen, hetzelfde gebied verlichten met een 365 nm UV-LED (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Duitsland) gedurende vijftien minuten. Na de UV-bestralingsperiode werd de distale tak van het MCA-resultaat opnieuw gekanaliseerd. Aan het einde van de procedure wordt de spier over het bot teruggeplaatst en wordt de huid gehecht.

Tijdens het experimentele tijdvenster zullen de onderzoekers de functionele stoornissen karakteriseren die worden veroorzaakt door de occlusie van de distale tak van de MCA met en zonder rekanalisatie.

Daartoe zullen de onderzoekers de neurodeficit-score gebruiken die het protocol wijzigt dat door Balbi en medewerkers in 2019 is toegepast, gebaseerd op een gestandaardiseerde kwalitatieve beoordeling voor het meten van de mate van motorische stoornissen (Bederson et al. 1986) waarbij een panel van vijf motorische tests wordt gebruikt om te evalueren kracht, balans en adductie- en flexievermogen.

In een subgroep muizen zullen de onderzoekers 24 uur na distale MCA-occlusie het ontstaan ​​van veranderingen in de bloed-hersenbarrière onderzoeken.

Daartoe injecteren de onderzoekers aan het einde van de operatie 0,20 ml Evans Blue-kleurstof (0,20 mg/ml) in de staartader van de muis om de distale tak van de MCA af te sluiten. 24 uur na de injectie wordt het dier verdoofd met een overdosis ketamine (50 mg/kg) en xylazine (9 mg/kg) en vervolgens geperfundeerd met 100 ml PBS om het bloed uit het hersenweefsel te verwijderen. De hersenen worden vervolgens geëxtraheerd en gedurende één uur geïncubeerd in PFA 4%. Vervolgens worden de hersenen doorgesneden met een hersenmatrix die ongeveer 15 plakjes van 1 mm dik produceert.

In een andere subgroep van muizen zullen de onderzoekers de uitbreiding van de laesie en de rekrutering van astrocyten karakteriseren 7 dagen na de inductie van de beroerte.

Daartoe zullen dieren worden verdoofd met een overdosis ketamine (50 mg/kg) en xylazine (9 mg/kg) en vervolgens transcardiaal geperfundeerd met 4% paraformaldehyde. Hersenen werden doorgesneden met behulp van een vibratome met vibrerende bladen (Leica, Duitsland) om 100 μm dikke coronale secties te verkrijgen voor immunokleuring van neuronale marker, NeuN (1: 1000, anti-NeuN-kip, Millipore, Duitsland) en Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP (1:1000, anti-GFAP-konijn, Abcam, Verenigd Koninkrijk).

De NeuN-immunokleuring zal worden uitgevoerd om het volume van de beroerte-laesie 7 dagen na fototrombose te kwantificeren. Het slagvolume voor elk dier wordt berekend door alle beschadigde gebieden op te tellen en het aantal te vermenigvuldigen met de sectiedikte en met 4 (de afstandsfactor). Afbeeldingen worden verkregen met een (Stemi 508, Carl Zeiss). Het totale volume in mm3 wordt gegeven als het gemiddelde ± standaardfout van alle geanalyseerde dieren.

Het aantal Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP) positieve neuronen zal worden geanalyseerd met behulp van een confocale fluorescentiemicroscoop (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japan) met een Nikon Plan EPO 60X objectief (NA 1.4, olie-immersie Nikon, Tokyo, Japan). De onderzoekers zullen ons onderzoek concentreren op 4 regio's die van belang zijn, namelijk het peri-infarctgebied (ischemische grenszone), een gebied in het ipsilesionaal halfrond dat ver verwijderd is van de kern van de beroerte (ipsilesional remote zone), een gebied contralateraal van het peri-infarctgebied (contralaterale ischemische grenszone) en een gebied in het gezonde halfrond contralateraal van de ischemische kern (contralaterale ischemische kern).