Akutt iskemisk slag: Fra laboratorium til pasientens SENG (STROKELABED)

Formålet med prosjektet er å evaluere korrelasjonen av sirkulerende biomarkører relatert til forstyrrelse av blod-hjernebarriere med utvikling av cerebralt ødem, hemorragisk transformasjon og utvidelsen av det iskemiske området undersøkt med moderne nevroimaging-teknikker, for å identifisere prediktorer for reperfusjonsskade i pasienter som gjennomgår revaskulariseringsbehandlinger.

Parallelt med den kliniske studien vil etterforskerne undersøke mekanistiske aspekter på sammenhengen mellom nevronal degenerasjon og endring av vaskulær permeabilitet. For dette formål vil etterforskerne bruke en kombinasjon av avanserte mikroskopiteknikker og vitale fluorescerende markeringer i en ny musemodell av iskemisk hjerneslag.

- Klinisk setting: Dette er en monosentrisk retrospektiv observasjonsstudie av pasienter med akutt iskemisk hjerneslag som har gjennomgått revaskulariseringsbehandlinger (systemisk trombolyse, endovaskulær behandling) ved hjerneslagenheten ved Careggi universitetssykehus fra 1. oktober 2015 til 31. mai 2020. Pasientdata vil bli lagt inn i et dedikert register: demografiske og kliniske data samt hematokjemiske og nevroavbildningsparametere som dekkes av denne studien. Tilgjengelige sirkulerende biomarkører og nevroimaging samlet ved sykehusankomst og gjentatt 24 timer etter intervensjoner vil bli inkludert i analysen, samt det kliniske/funksjonelle utfallet vurdert 3 måneder etter hjerneslag i henhold til den modifiserte Rankin-skalaen ved besøk eller telefonintervju.

Laboratorieprotokoll:

På vårt universitetssykehus blir det rutinemessig tatt blodprøver hos pasienter med akutt iskemisk slag før og 24 timer etter reperfusjonsbehandling (enten intravenøs trombolyse eller endovaskulær trombektomi). Etterforskerne kunne hente ut blodprøver som allerede er brukt for en tidligere studie (Piccardi et al. 2018) og fortsatt riktig lagret og tilgjengelig i vår biologiske bank: blod samles i rør både med antikoagulant og uten antikoagulant. Rørene sentrifugeres deretter ved romtemperatur ved 1500 x g i 15 minutter, og supernatanten lagres i alikvoter ved -80°C.

Nevroimaging protokoll:

Baseline nevroimaging vurdering, inkludert non-contrast CT (NCCT), CT-angiografi (CTA) og CT-perfusjon (CTP) har blitt utført før akutte intervensjoner når det er indisert i henhold til retningslinjer på plass på behandlingstidspunktet. En 24 timers oppfølging NCCT er utført hos alle pasienter.

Etter 24 timer, i henhold til internasjonale retningslinjer, gjennomgår alle pasienter en kontrollhode-CT eller hjerne-MR for å bestemme tilstedeværelsen av hemoragisk transformasjon, cerebralt ødem og volumet av det iskemiske området. Omlesingen av bildene som allerede er anskaffet vil bli utført i DICOM-format. Dataene som samles inn vil bli registrert i en spesiell del av det elektroniske registeret.

To ekspertnevrologer vil separat evaluere hver pasients baseline og 24-timers CT og registrere tilstedeværelsen av cerebralt ødem klassifisert i henhold til SITS-ISTR-kriteriene: COED1 = fokal hjernehevelse opp til en tredjedel av halvkulen, COED2 = fokal hjernehevelse større enn en tredjedel av halvkulen, COED3 = hjernehevelse med midtlinjeforskyvning, INGEN = fravær av cerebralt ødem. De to uavhengige nevrologene vil også lage en manuell kartlegging ("maske") av den iskemiske lesjonen som er synlig på 24-timers CT-skanning. Eventuelle avvik vil bli løst av en erfaren nevroradiolog. For denne prosessen vil FSLeyes bli brukt, en programvare inkludert i FSL-programvaren (FMRIB Software Library v6.0, Created by Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) som gir muligheten til å generere en tredimensjonal lesjonsmaske for hver pasient , som dekker infarktvevet på alle CT-seksjoner. Tidligere iskemiske utfall (allerede til stede på baseline CT) vil ikke inkluderes i maskene.

Anatomisk forvrengning (AD) vil bli vurdert ved å sammenligne baseline CT med 24-timers CT. Trinnene som kreves for å oppnå denne målingen inkluderer å avgrense den iskemiske lesjonen som er synlig etter 24 timer ved hjelp av en "maske" (beskrevet før) og registrering, en prosedyre som gjør det mulig å nøyaktig sammenligne forskjellige bilder av hjernen, selv til forskjellige tider og individer. AD kan beregnes ved å sammenligne de to mulige registreringstilnærmingene og spesielt ved å kvantifisere forskjellen mellom lesjonsmaskene behandlet gjennom lineær og ikke-lineær registrering i henhold til metoden beskrevet av Harston et al. i 2018. All bildebehandling og analyse vil bli utført ved hjelp av FSL-programvare (FMRIB Software Library v6.0, Laget av Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), en gratis tilgangsprogramvare utviklet av en forskningsgruppe ved University of Oxford.

3 måneders utfall: Alle pasienter behandlet med systemisk trombolyse eller endovaskulær behandling følges opp 3 måneder etter den iktale hendelsen med en evaluering av det klinisk-funksjonelle utfallet i henhold til den modifiserte Rankin-skalaen, direkte i poliklinikken eller ved telefonintervju. .

Disse dataene må derfor hentes fra polikliniske rapporter. Kun dersom data mangler vil det bli gjennomført et telefonintervju.

- Pre-klinisk setting: Den prekliniske forskningsgruppen vil karakterisere en ny musemodell for okklusjon/reperfusjon av MCA. Alle prosedyrer som involverer mus vil bli utført i samsvar med forskrifter fra det italienske helsedepartementets autorisasjon nr. 723/2019.

Mus vil bli bedøvet med ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg). Kroppstemperaturen holdes på 37°C med en varmepute. Mus vil bli plassert på en operasjonspute, liggende på den ene siden. Musehårene mellom øyet og øret fjernes og deretter renses huden med betadin og etanol. Deretter påføres lokalbedøvelse lidokain 2 %. Huden over squamosalbeinet vil bli kuttet med et blad, muskelen vil løsnes fra skallen og dyttes forsiktig ned for å eksponere beinet.

Deretter vil en tannbor (Silfradent, Italia) brukes til å lage en liten kraniotomi for å avsløre den distale grenen av den midtre cerebrale arterien. Når klaffebenet er fjernet, vil et lysfølsomt fargestoff, Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml løsning i saltvannsoppløsning; Sigma Aldrich, USA) injiseres intraperitonealt. Fem minutter etter injeksjonen vil en 532 nm laser (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Tyskland) bli fokusert oppstrøms for MCA-forgreningen i tjuefem minutter for å indusere dannelsen av en stabil koagel. 30 minutter etter okklusjonen av den distale grenen av MCA, for å fremme forstyrrelsen av koaguleringen og den påfølgende rekanaliseringen av blodåren, vil etterforskerne belyse den samme regionen med en 365 nm UV LED (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Tyskland) i femten minutter. Etter UV-bestrålingsperioden rekanaliserte den distale grenen av MCA-resultatet. På slutten av prosedyren vil muskelen bli erstattet over beinet og huden suturert.

I løpet av det eksperimentelle tidsvinduet vil etterforskerne karakterisere funksjonssvikt indusert av okklusjon av den distale grenen av MCA med og uten rekanalisering.

Til dette målet vil etterforskerne bruke nevrodeficit-skåren som endrer protokollen som ble brukt av Balbi og medarbeidere i 2019, basert på en standardisert kvalitativ vurdering for å måle graden av motorisk svekkelse (Bederson et al. 1986) ved å bruke et panel med fem motoriske tester for å evaluere styrke, balanse og adduksjons- og fleksjonsevne.

I en undergruppe av mus vil etterforskerne undersøke fremveksten av blod-hjerne-barriereendringer 24 timer etter distal MCA-okklusjon.

For dette formålet vil etterforskerne injisere 0,20 ml Evans Blue-fargestoff (0,20 mg/ml) i musehalevenen ved slutten av operasjonen for å okkludere den distale grenen av MCA. 24 timer etter injeksjonen vil dyret bli bedøvet med en overdose av ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg) og deretter perfusert med 100 ml PBS for å fjerne blodet fra hjernevevet. Hjernen vil deretter bli ekstrahert og inkubert i PFA 4% i en time. Deretter vil hjernen bli seksjonert med en hjernematrise som produserer omtrent 15 skiver 1 mm tykke.

I en annen undergruppe av mus vil etterforskerne karakterisere lesjonsforlengelse og rekruttering av astrocytter 7 dager etter induksjon av hjerneslag.

For dette formålet vil dyr bli bedøvet med en overdose av ketamin (50 mg/kg) og xylazin (9 mg/kg) og deretter transkardialt perfusert med 4 % paraformaldehyd. Hjerner ble kuttet ved hjelp av et vibratom med vibrerende blad (Leica, Tyskland) for å oppnå 100 µm tykke koronale seksjoner for immunfarging av Neuronal markør, NeuN (1:1000, anti-NeuN kylling, Millipore, Tyskland), og Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP (1:1000, anti-GFAP-kanin, Abcam, Storbritannia).

NeuN immunfarging vil bli utført for å kvantifisere slaglesjonsvolum 7 dager etter fototrombose. Slagvolumet for hvert dyr vil bli beregnet ved å summere alle skadede områder og multiplisere antallet med snitttykkelse og med 4 (avstandsfaktoren). Bilder vil bli anskaffet med en (Stemi 508, Carl Zeiss). Det totale volumet i mm3 vil bli gitt som gjennomsnitt ± standardfeil for alle analyserte dyr.

Antallet Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP) positive nevroner vil bli analysert ved hjelp av et konfokalt fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japan) med et Nikon Plan EPO 60X objektiv (NA 1.4, oljenedsenking Nikon, Tokyo, Japan). Etterforskerne vil fokusere vår undersøkelse på 4 områder av interesse, det vil si peri-infarktområdet (iskemisk grensesone), en region i den ipsilesionale halvkulen fjernt fra hjerneslagkjernen (ipsilesional fjernsone), en region kontralateral til peri-infarktområdet (kontralateral iskemisk grensesone), og en region i den friske halvkule kontralateral til den iskemiske kjernen (kontralateral iskemisk kjerne).