AVC isquêmico agudo: do laboratório ao leito do paciente (STROKELABED)

O objetivo do projeto é avaliar a correlação de biomarcadores circulantes relacionados à ruptura da barreira hematoencefálica com o desenvolvimento de edema cerebral, transformação hemorrágica e extensão da área isquêmica investigados com técnicas modernas de neuroimagem, a fim de identificar preditores de lesão de reperfusão em pacientes submetidos a terapias de revascularização.

Paralelamente ao estudo clínico, os pesquisadores investigarão aspectos mecanísticos sobre a correlação entre a degeneração neuronal e a alteração da permeabilidade vascular. Para esse fim, os pesquisadores usarão uma combinação de técnicas avançadas de microscopia e marcações fluorescentes vitais em um novo modelo de AVC isquêmico em camundongos.

- Contexto clínico: Este é um estudo observacional retrospectivo monocêntrico de pacientes com AVC isquêmico agudo submetidos a terapias de revascularização (trombólise sistêmica, tratamento endovascular) na Unidade de AVC do Hospital Universitário de Careggi de 1º de outubro de 2015 a 31 de maio de 2020. Os dados dos pacientes serão inseridos em um registro dedicado: dados demográficos e clínicos, bem como parâmetros hematoquímicos e de neuroimagem cobertos por este estudo. Biomarcadores circulantes disponíveis e neuroimagem coletados na chegada ao hospital e repetidos 24 horas após as intervenções serão incluídos na análise, bem como o resultado clínico/funcional avaliado 3 meses após o AVC de acordo com a escala de Rankin modificada por visita ou entrevista por telefone.

Protocolo laboratorial:

Em nosso hospital universitário, em pacientes com AVC isquêmico agudo, amostras de sangue são rotineiramente coletadas antes e 24 horas após o tratamento de reperfusão (trombólise intravenosa ou trombectomia endovascular). Os investigadores puderam recuperar amostras de sangue já usadas em um estudo anterior (Piccardi et al. 2018) e ainda armazenadas corretamente e disponíveis em nosso banco biológico: o sangue é coletado em tubos com anticoagulante e sem anticoagulante. Os tubos são então centrifugados à temperatura ambiente a 1500 x g por 15 minutos, e o sobrenadante é armazenado em alíquotas a -80°C.

Protocolo de neuroimagem:

A avaliação basal de neuroimagem, incluindo TC sem contraste (NCCT), angiografia por TC (CTA) e perfusão por TC (CTP) foi realizada antes de intervenções agudas quando indicadas de acordo com as diretrizes em vigor no momento do tratamento. Um NCCT de acompanhamento de 24 horas foi realizado em todos os pacientes.

Após 24 horas, de acordo com as diretrizes internacionais, todos os pacientes são submetidos a uma tomografia computadorizada de crânio ou ressonância magnética cerebral de controle para determinar a presença de transformação hemorrágica, edema cerebral e o volume da área isquêmica. A releitura das imagens já adquiridas será realizada no formato DICOM. Os dados recolhidos serão registados numa secção especial do registo eletrónico.

Dois neurologistas especialistas avaliarão separadamente a TC basal e de 24 horas de cada paciente e registrarão a presença de edema cerebral classificado de acordo com os critérios SITS-ISTR: COED1 = edema cerebral focal até um terço do hemisfério, COED2 = edema cerebral focal maior que um terço do hemisfério, COED3 = edema cerebral com desvio da linha média, NENHUM = ausência de edema cerebral. Os dois neurologistas independentes também criarão um mapeamento manual ("máscara") da lesão isquêmica visível na tomografia computadorizada de 24 horas. Quaisquer discrepâncias serão resolvidas por um neurorradiologista experiente. Para este processo, será utilizado o FSLeyes, um software incluído no software FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) que oferece a possibilidade de gerar uma máscara de lesão tridimensional para cada paciente, cobrindo o tecido do infarto em todas as seções de TC. Resultados isquêmicos anteriores (já presentes na TC basal) não serão incluídos nas máscaras.

A distorção anatômica (AD) será avaliada comparando a TC basal com a TC de 24 horas. As etapas necessárias para obter essa medida incluem o delineamento da lesão isquêmica visível em 24 horas usando uma "máscara" (descrita anteriormente) e o registro, procedimento que permite comparar com precisão diferentes imagens do cérebro, mesmo em momentos e indivíduos diferentes. O AD pode ser calculado comparando as duas abordagens de registro possíveis e, em particular, quantificando a diferença entre as máscaras de lesão processadas por meio de registro linear e não linear de acordo com o método descrito por Harston et al. em 2018. Todo o processamento e análise das imagens serão realizados no software FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), software de acesso livre desenvolvido por um grupo de pesquisa da Universidade de Oxford.

Resultado em 3 meses: Todos os pacientes tratados com trombólise sistêmica ou tratamento endovascular são acompanhados 3 meses após o evento ictal com avaliação do resultado clínico-funcional de acordo com a Escala de Rankin modificada, diretamente no ambulatório ou por entrevista telefônica .

Esses dados devem, portanto, ser adquiridos a partir de relatórios ambulatoriais. Somente se os dados estiverem faltando, uma entrevista por telefone será realizada.

- Cenário pré-clínico: O grupo de pesquisa pré-clínica caracterizará um novo modelo de camundongo de oclusão/reperfusão do MCA. Todos os procedimentos envolvendo camundongos serão realizados de acordo com os regulamentos do Ministério da Saúde da Itália, autorização n. 723/2019.

Camundongos serão anestesiados com cetamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg). A temperatura corporal será mantida a 37°C com uma almofada de aquecimento. Os camundongos serão colocados em uma almofada de cirurgia, deitados de lado. Os pelos do rato entre o olho e a orelha serão removidos e, em seguida, a pele será limpa com betadine e etanol. Em seguida, será aplicado o anestésico local lidocaína 2%. A pele sobre o osso escamoso será cortada com uma lâmina, o músculo será separado do crânio e gentilmente empurrado para baixo para expor o osso.

Em seguida, uma broca odontológica (Silfradent, Italia) será usada para criar uma pequena craniotomia para expor o ramo distal da artéria cerebral média. Uma vez removido o osso do retalho, um corante fotossensível, Rosebengal (0,2 ml, solução de 10 mg/ml em solução salina; Sigma Aldrich, EUA) será injetado por via intraperitoneal. Cinco minutos após a injeção, um laser de 532 nm (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Alemanha) será focalizado a montante da ramificação MCA por vinte e cinco minutos para induzir a formação de um coágulo estável. Trinta minutos após a oclusão do ramo distal da MCA, a fim de promover o rompimento do coágulo e a consequente recanalização do vaso sanguíneo, os investigadores iluminarão a mesma região com LED UV 365 nm (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Alemanha) por quinze minutos. Após o período de irradiação UV, o ramo distal do resultado MCA foi recanalizado. Ao final do procedimento, o músculo será recolocado sobre o osso e a pele suturada.

Durante a janela de tempo experimental os investigadores irão caracterizar o comprometimento funcional induzido pela oclusão do ramo distal da MCA com e sem recanalização.

Para isso, os pesquisadores usarão o escore de neurodéficit modificando o protocolo aplicado por Balbi e colaboradores em 2019, com base em uma avaliação qualitativa padronizada para medir o grau de comprometimento motor (Bederson et al. 1986) empregando um painel de cinco testes motores para avaliar força, equilíbrio e capacidade de adução e flexão.

Em um subgrupo de camundongos, os pesquisadores investigarão o surgimento de alterações na barreira hematoencefálica 24 horas após a oclusão distal da MCA.

Para tanto, os investigadores injetarão na veia da cauda do camundongo 0,20 mL de corante Evans Blue (0,20 mg/mL), ao final da cirurgia para ocluir o ramo distal da MCA. 24 horas após a injeção o animal será anestesiado com overdose de ketamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg) e então perfundido com 100 mL de PBS para retirada do sangue do tecido cerebral. O cérebro será então extraído e incubado em PFA 4% por uma hora. Em seguida, o cérebro será seccionado com uma matriz cerebral produzindo aproximadamente 15 fatias de 1 mm de espessura.

Em outro subgrupo de camundongos, os investigadores caracterizarão a extensão da lesão e o recrutamento de astrócitos 7 dias após a indução do AVC.

Para tanto, os animais serão anestesiados com overdose de cetamina (50 mg/kg) e xilazina (9 mg/kg) e perfundidos transcardialmente com paraformaldeído a 4%. Os cérebros foram cortados usando um vibratome de lâmina vibratória (Leica, Alemanha) para obter seções coronais de 100 µm de espessura para imunocoloração do marcador Neuronal, NeuN (1:1000, frango anti-NeuN, Millipore, Alemanha) e proteína ácida fibrilar glial, GFAP (1:1000, coelho anti-GFAP, Abcam, Reino Unido).

A imunocoloração de NeuN será realizada para quantificar o volume da lesão encefálica 7 dias após a fototrombose. O volume de ejeção para cada animal será calculado somando todas as áreas danificadas e multiplicando o número pela espessura da seção e por 4 (o fator de espaçamento). As imagens serão adquiridas com um (Stemi 508, Carl Zeiss). O volume total em mm3 será dado como a média ± erro padrão de todos os animais analisados.

O número de neurônios Glial Fibrillary Acid Protein (GFAP) positivos será analisado usando um microscópio confocal de fluorescência (Nikon Eclipse TE 300, Tóquio, Japão) com uma objetiva Nikon Plan EPO 60X (NA 1.4, imersão em óleo Nikon, Tóquio, Japão). Os investigadores irão centrar a nossa investigação em 4 regiões de interesse, ou seja, a área peri-infarto (zona de fronteira isquêmica), uma região no hemisfério ipsilesional distante do núcleo do acidente vascular cerebral (zona remota ipsilesional), uma região contralateral à área peri-infarto (zona de borda isquêmica contralateral) e uma região no hemisfério saudável contralateral ao núcleo isquêmico (núcleo isquêmico contralateral).