AVC ischémique aigu : du laboratoire au lit du patient (STROKELABED)

Le but du projet est d'évaluer la corrélation des biomarqueurs circulants liés à la perturbation de la barrière hémato-encéphalique avec le développement d'un œdème cérébral, la transformation hémorragique et l'extension de la zone ischémique étudiée avec des techniques modernes de neuroimagerie, afin d'identifier des prédicteurs de lésions de reperfusion chez patients sous traitement de revascularisation.

En parallèle de l'étude clinique, les chercheurs investigueront les aspects mécanistes de la corrélation entre la dégénérescence neuronale et l'altération de la perméabilité vasculaire. À cette fin, les chercheurs utiliseront une combinaison de techniques de microscopie avancées et de marquages ​​fluorescents vitaux dans un nouveau modèle murin d'AVC ischémique.

- Contexte clinique : Il s'agit d'une étude observationnelle rétrospective monocentrique de patients ayant subi un AVC ischémique aigu ayant subi des thérapies de revascularisation (thrombolyse systémique, traitement endovasculaire) à l'unité AVC de l'hôpital universitaire Careggi du 1er octobre 2015 au 31 mai 2020. Les données des patients seront saisies dans un registre dédié : données démographiques et cliniques ainsi que les paramètres hématochimiques et de neuroimagerie couverts par cette étude. Les biomarqueurs circulants disponibles et la neuroimagerie recueillis à l'arrivée à l'hôpital et répétés 24 heures après les interventions seront inclus dans l'analyse, ainsi que le résultat clinique/fonctionnel évalué 3 mois après l'AVC selon l'échelle de Rankin modifiée par visite ou entretien téléphonique.

Protocole de laboratoire :

Dans notre hôpital universitaire, chez les patients victimes d'un AVC ischémique aigu, des échantillons de sang sont systématiquement prélevés avant et 24 heures après le traitement de reperfusion (soit par thrombolyse intraveineuse, soit par thrombectomie endovasculaire). Les investigateurs ont pu récupérer des échantillons de sang déjà utilisés pour une étude précédente (Piccardi et al. 2018) et toujours correctement conservés et disponibles dans notre banque biologique : le sang est prélevé dans des tubes avec anticoagulant et sans anticoagulant. Les tubes sont ensuite centrifugés à température ambiante à 1500 x g pendant 15 minutes, et le surnageant est stocké en aliquotes à -80°C.

Protocole de neuroimagerie :

L'évaluation de base par neuroimagerie, y compris la TDM sans contraste (NCCT), la TDM-angiographie (CTA) et la TDM-perfusion (CTP) a été effectuée avant les interventions aiguës lorsqu'elles sont indiquées conformément aux directives en vigueur au moment du traitement. Une NCCT de suivi de 24 heures a été réalisée chez tous les patients.

Après 24 heures, conformément aux directives internationales, tous les patients subissent un scanner cérébral de contrôle ou une IRM cérébrale pour déterminer la présence d'une transformation hémorragique, d'un œdème cérébral et du volume de la zone ischémique. La relecture des images déjà acquises sera effectuée au format DICOM. Les données collectées seront enregistrées dans une section spéciale du registre électronique.

Deux neurologues experts évalueront séparément la ligne de base et le scanner de 24 heures de chaque patient et enregistreront la présence d'un œdème cérébral classé selon les critères SITS-ISTR : COED1 = gonflement cérébral focal jusqu'à un tiers de l'hémisphère, COED2 = gonflement cérébral focal supérieur à un tiers de l'hémisphère, COED3 = gonflement cérébral avec déplacement de la ligne médiane, AUCUN = absence d'œdème cérébral. Les deux neurologues indépendants créeront également une cartographie manuelle (« masque ») de la lésion ischémique visible sur le scanner de 24 heures. Toute divergence sera résolue par un neuroradiologue expérimenté. Pour ce processus, FSLeyes sera utilisé, un logiciel inclus dans le logiciel FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created by the Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK) qui offre la possibilité de générer un masque de lésion tridimensionnel pour chaque patient, couvrant le tissu de l'infarctus sur toutes les coupes CT. Les résultats ischémiques antérieurs (déjà présents sur le CT de base) ne seront pas inclus dans les masques.

La distorsion anatomique (AD) sera évaluée en comparant le CT de base au CT de 24 heures. Les étapes nécessaires pour obtenir cette mesure comprennent la délimitation de la lésion ischémique visible à 24 heures à l'aide d'un "masque" (décrit précédemment) et l'enregistrement, une procédure qui permet de comparer avec précision différentes images du cerveau, même à des moments et des individus différents. La DA peut être calculée en comparant les deux approches de recalage possibles et notamment en quantifiant la différence entre les masques lésionnels traités par recalage Linéaire et Non-Linéaire selon la méthode décrite par Harston et al. en 2018. Tous les traitements et analyses d'images seront effectués à l'aide du logiciel FSL (FMRIB Software Library v6.0, créé par le groupe d'analyse, FMRIB, Oxford, Royaume-Uni), un logiciel en libre accès développé par un groupe de recherche de l'Université d'Oxford.

Résultat à 3 mois : Tous les patients traités par thrombolyse systémique ou traitement endovasculaire sont suivis 3 mois après l'événement critique avec une évaluation du résultat clinico-fonctionnel selon l'échelle de Rankin modifiée, directement en clinique externe ou par entretien téléphonique .

Ces données doivent donc être acquises à partir des rapports des patients externes. Ce n'est que si les données sont manquantes qu'un entretien téléphonique sera réalisé.

- Cadre préclinique : Le groupe de recherche préclinique caractérisera un nouveau modèle murin d'occlusion/reperfusion de la MCA. Toutes les procédures impliquant des souris seront effectuées conformément aux réglementations de l'autorisation du ministère italien de la santé n. 723/2019.

Les souris seront anesthésiées avec de la kétamine (50 mg/kg) et de la xylazine (9 mg/kg). La température corporelle sera maintenue à 37°C avec un coussin chauffant. Les souris seront placées sur un bloc opératoire, allongées sur un côté. Les poils de souris entre l'œil et l'oreille seront enlevés puis la peau sera nettoyée avec de la bétadine et de l'éthanol. Ensuite, un anesthésique local lidocaïne 2% sera appliqué. La peau sur l'os squamosal sera coupée avec une lame, le muscle sera détaché du crâne et doucement poussé vers le bas pour exposer l'os.

Ensuite, une fraise dentaire (Silfradent, Italia) sera utilisée pour créer une petite craniotomie afin d'exposer la branche distale de l'artère cérébrale moyenne. Une fois le volet osseux retiré, un colorant photosensible, Rosebengal (0,2 ml, solution à 10 mg/ml dans une solution saline ; Sigma Aldrich, USA) sera injecté par voie intrapéritonéale. Cinq minutes après l'injection, un laser de 532 nm (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Allemagne) sera focalisé en amont de la ramification MCA pendant vingt-cinq minutes pour induire la formation d'un caillot stable. Trente minutes après l'occlusion de la branche distale du MCA, afin de favoriser la rupture du caillot et la recanalisation conséquente du vaisseau sanguin, les enquêteurs éclaireront la même région avec une LED UV 365 nm (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Allemagne) pendant quinze minutes. Après la période d'irradiation UV, la branche distale du résultat MCA s'est recanalisée. À la fin de la procédure, le muscle sera replacé sur l'os et la peau suturée.

Au cours de la fenêtre temporelle expérimentale, les chercheurs caractériseront l'altération fonctionnelle induite par l'occlusion de la branche distale du MCA avec et sans recanalisation.

À cette fin, les enquêteurs utiliseront le score de neurodéficit modifiant le protocole appliqué par Balbi et ses collaborateurs en 2019, basé sur une évaluation qualitative standardisée pour mesurer le degré de déficience motrice (Bederson et al. 1986) employant un panel de cinq tests moteurs pour évaluer la force, l'équilibre et la capacité d'adduction et de flexion.

Dans un sous-groupe de souris, les chercheurs étudieront l'émergence d'altérations de la barrière hémato-encéphalique 24 heures après l'occlusion distale du MCA.

Dans ce but, les enquêteurs injecteront dans la veine caudale de la souris 0,20 mL de colorant Evans Blue (0,20 mg/mL), à la fin de la chirurgie pour obstruer la branche distale du MCA. 24 heures après l'injection l'animal sera anesthésié avec une surdose de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (9 mg/kg) puis perfusé avec 100 mL de PBS afin d'éliminer le sang du tissu cérébral. Le cerveau sera ensuite extrait et incubé dans du PFA 4% pendant une heure. Ensuite, le cerveau sera sectionné avec une matrice cérébrale produisant environ 15 tranches de 1 mm d'épaisseur.

Dans un autre sous-groupe de souris, les chercheurs caractériseront l'extension des lésions et le recrutement des astrocytes 7 jours après l'induction de l'AVC.

Dans ce but, les animaux seront anesthésiés avec une surdose de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (9 mg/kg) puis perfusés par voie transcardiaque avec du paraformaldéhyde à 4 %. Les cerveaux ont été coupés à l'aide d'un vibratome à lame vibrante (Leica, Allemagne) pour obtenir des coupes coronales de 100 µm d'épaisseur pour l'immunomarquage du marqueur neuronal, NeuN (1:1000, poulet anti-NeuN, Millipore, Allemagne) et de la protéine acide fibrillaire gliale, GFAP (1:1000, lapin anti-GFAP, Abcam, Royaume-Uni).

L'immunomarquage NeuN sera effectué pour quantifier le volume de la lésion cérébrale 7 jours après la photothrombose. Le volume systolique pour chaque animal sera calculé en additionnant toutes les zones endommagées et en multipliant le nombre par l'épaisseur de la section et par 4 (le facteur d'espacement). Les images seront acquises avec un (Stemi 508, Carl Zeiss). Le volume total en mm3 sera donné comme la moyenne ± erreur standard de tous les animaux analysés.

Le nombre de neurones positifs pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) sera analysé à l'aide d'un microscope confocal à fluorescence (Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japon) avec un objectif Nikon Plan EPO 60X (NA 1.4, immersion dans l'huile Nikon, Tokyo, Japon). Les enquêteurs concentreront notre enquête sur 4 régions d'intérêt, à savoir la zone péri-infarctus (zone frontière ischémique), une région de l'hémisphère ipsilésionnel éloignée du cœur de l'AVC (zone distante ipsilésionnelle), une région contralatérale à la zone péri-infarctus (zone frontalière ischémique controlatérale) et une région dans l'hémisphère sain controlatéral au noyau ischémique (noyau ischémique controlatéral).