급성 허혈성 뇌졸중: 검사실에서 환자 침대까지 (STROKELABED)

이 프로젝트의 목적은 혈액뇌장벽 파괴와 관련된 순환 바이오마커와 뇌부종의 발생, 출혈성 변형 및 현대 신경영상 기술로 조사된 허혈 영역의 확장과의 상관관계를 평가하여 재관류 손상의 예측 인자를 식별하는 것입니다. 혈관재생요법을 받고 있는 환자.

임상 연구와 병행하여 연구자들은 신경 변성과 혈관 투과성의 변화 사이의 상관관계에 대한 기계론적 측면을 조사할 것입니다. 이를 위해 연구자들은 허혈성 뇌졸중의 새로운 마우스 모델에서 고급 현미경 기술과 중요한 형광 표시의 조합을 사용할 것입니다.

- 임상 환경: 2015년 10월 1일부터 2020년 5월 31일까지 Careggi 대학병원 뇌졸중 병동에서 혈관재개통 요법(전신혈전용해제, 혈관내 치료)을 받은 급성 허혈성 뇌졸중 환자를 대상으로 한 단일 중심 후향적 관찰 연구입니다. 환자의 데이터는 전용 등록부에 입력됩니다: 이 연구에서 다루는 인구 통계 및 임상 데이터는 물론 혈액 화학 및 신경 영상 매개변수. 병원 도착 시 수집되고 개입 후 24시간 동안 반복되는 사용 가능한 순환 바이오마커 및 신경영상이 분석에 포함될 뿐만 아니라 방문 또는 전화 인터뷰를 통해 수정된 Rankin 척도에 따라 뇌졸중 후 3개월에 평가된 임상/기능적 결과가 포함됩니다.

실험실 프로토콜:

우리 대학병원에서는 급성 허혈성 뇌졸중 환자의 혈액 샘플을 재관류 치료(정맥 혈전 용해 또는 혈관 내 혈전 제거술) 전과 후 24시간에 정기적으로 채취합니다. 조사관은 이전 연구(Piccardi et al. 2018)에 이미 사용된 혈액 샘플을 검색할 수 있으며 여전히 올바르게 저장되어 있으며 우리의 생물학적 은행에서 사용할 수 있습니다. 혈액은 항응고제가 있는 튜브와 항응고제가 없는 튜브에 수집됩니다. 그런 다음 튜브를 실온에서 1500 x g로 15분 동안 원심분리하고 상청액을 -80°C에서 분취량으로 저장합니다.

신경영상 프로토콜:

비조영 CT(NCCT), CT-혈관조영술(CTA) 및 CT-관류(CTP)를 포함한 기본 신경영상 평가는 치료 시점에 시행된 지침에 따라 지시된 경우 급성 개입 전에 수행되었습니다. 모든 환자에서 24시간 추적 NCCT가 수행되었습니다.

24시간 후, 국제 지침에 따라 모든 환자는 출혈성 변형, 뇌부종 및 허혈 부위의 부피를 확인하기 위해 제어 머리 CT 또는 뇌 MRI를 받습니다. 이미 획득한 이미지의 다시 읽기는 DICOM 형식으로 수행됩니다. 수집된 데이터는 전자 등록부의 특별 섹션에 기록됩니다.

두 명의 전문 신경과 전문의가 각 환자의 기준선과 24시간 CT를 개별적으로 평가하고 SITS-ISTR 기준에 따라 분류된 뇌부종의 존재를 기록합니다: COED1 = 반구의 1/3까지 초점 뇌 부종, COED2 = 반구의 1/3, COED3 = 정중선 이동이 있는 뇌 부종, NONE = 뇌부종 없음. 두 명의 독립적인 신경과 전문의는 또한 24시간 CT 스캔에서 볼 수 있는 허혈성 병변의 수동 매핑("마스크")을 생성합니다. 모든 불일치는 경험이 풍부한 신경 방사선 전문의가 해결합니다. 이 프로세스를 위해 각각에 대해 3차원 병변 마스크를 생성할 수 있는 가능성을 제공하는 FSL 소프트웨어(FMRIB 소프트웨어 라이브러리 v6.0, 분석 그룹에서 생성, FMRIB, 옥스포드, 영국)에 포함된 소프트웨어인 FSLeyes가 사용됩니다. 모든 CT 섹션의 경색 조직을 덮는 환자. 이전 허혈성 결과(기준선 CT에 이미 있음)는 마스크에 포함되지 않습니다.

해부학적 왜곡(AD)은 기준선 CT와 24시간 CT를 비교하여 평가합니다. 이 측정값을 얻는 데 필요한 단계에는 "마스크"(이전에 설명됨)를 사용하여 24시간에 보이는 허혈성 병변의 윤곽을 그리는 것과 등록, 다른 시간과 개인에서도 뇌의 다른 이미지를 정확하게 비교할 수 있는 절차가 포함됩니다. AD는 두 가지 가능한 등록 방법을 비교하여 계산할 수 있으며 특히 Harston 등이 설명한 방법에 따라 선형 및 비선형 등록을 통해 처리된 병변 마스크 간의 차이를 정량화하여 계산할 수 있습니다. 2018년. 모든 이미지 처리 및 분석은 옥스포드 대학의 연구 그룹이 개발한 무료 액세스 소프트웨어인 FSL 소프트웨어(FMRIB 소프트웨어 라이브러리 v6.0, 분석 그룹, FMRIB, 옥스포드, 영국에서 생성)를 사용하여 수행됩니다.

3개월 결과: 전신 혈전용해제 또는 혈관내 치료를 받은 모든 환자는 수정된 Rankin 척도에 따라 임상 기능적 결과 평가와 함께 발작 사건 3개월 후 외래 환자 클리닉에서 직접 또는 전화 인터뷰를 통해 추적 관찰됩니다. .

따라서 이 데이터는 외래 환자 보고서에서 획득해야 합니다. 데이터가 누락된 경우에만 전화 인터뷰를 실시합니다.

- 전임상 설정: 전임상 연구 그룹은 MCA 폐색/재관류의 새로운 마우스 모델을 특성화합니다. 마우스와 관련된 모든 절차는 이탈리아 보건부 승인 n의 규정에 따라 수행됩니다. 723/2019.

마우스는 케타민(50mg/kg) 및 자일라진(9mg/kg)으로 마취됩니다. 발열 패드로 체온을 37°C로 유지합니다. 마우스는 한쪽에 누워 수술 패드에 배치됩니다. 눈과 귀 사이의 마우스 털을 제거한 다음 베타딘과 에탄올로 피부를 청소합니다. 그런 다음 국소 마취 리도카인 2%를 도포합니다. squamosal 뼈 위의 피부는 칼날로 절단되고, 근육은 두개골에서 분리되고 부드럽게 아래로 눌러 뼈가 노출됩니다.

그런 다음 치과 용 드릴 (Silfradent, Italia)을 사용하여 중간 대뇌 동맥의 원위 가지를 노출시키기 위해 작은 개두술을 만듭니다. 플랩 뼈를 제거한 후 감광성 염료 인 Rosebengal (0.2 ml, 10 mg / ml 식염수 용액, Sigma Aldrich, USA)을 복강 내 주사합니다. 주입 5분 후, 532 nm 레이저(Laser Diode CPS532, Thorlabs, Germany)가 안정적인 응고 형성을 유도하기 위해 25분 동안 MCA 분지의 상류에 초점을 맞출 것입니다. MCA 원위 분지의 폐색 30분 후, 혈전의 붕괴와 이에 따른 혈관의 재개통을 촉진하기 위해 연구자들은 365nm UV LED(High-Power LED SOLIS)로 동일한 영역을 조명합니다. -365C, Thorlabs, 독일)에서 15분 동안. UV 조사 기간 후, MCA 결과의 원위 분지는 재개통되었습니다. 절차가 끝나면 근육이 뼈 위에 교체되고 피부가 봉합됩니다.

실험 시간 창 동안 수사관은 재관통이 있거나 없는 MCA의 원위 분지의 폐색에 의해 유도된 기능 장애를 특성화합니다.

이를 위해 조사관은 2019년 Balbi와 공동 작업자가 적용한 프로토콜을 수정한 신경결핍 점수를 사용하여 운동 손상 정도를 측정하기 위한 표준화된 정성적 평가(Bederson et al. 1986)를 기반으로 평가할 5가지 운동 테스트 패널을 사용합니다. 근력, 균형, 내전 및 굴곡 능력.

마우스 하위 그룹에서 조사관은 원위 MCA 폐색 후 24시간 후에 혈액-뇌 장벽 변경의 출현을 조사할 것입니다.

이를 위해 조사관은 MCA의 원위 분지를 폐색하기 위해 수술이 끝날 때 마우스 꼬리 정맥 0.20mL의 Evans Blue 염료(0.20mg/mL)를 주입합니다. 주사 24시간 후 동물은 케타민(50mg/kg)과 자일라진(9mg/kg)의 과다 복용으로 마취된 다음 뇌 조직에서 혈액을 제거하기 위해 100mL의 PBS로 관류됩니다. 그런 다음 뇌를 추출하여 PFA 4%에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 뇌는 1mm 두께의 약 15개 슬라이스를 생성하는 뇌 매트릭스로 절단됩니다.

마우스의 또 다른 하위 그룹에서 연구자들은 뇌졸중 유도 7일 후 병변 확장 및 성상세포 모집을 특성화할 것입니다.

이를 위해 동물은 케타민(50mg/kg)과 자일라진(9mg/kg)의 과다 복용으로 마취된 다음 4% 파라포름알데히드로 경심 관류됩니다. 신경 마커, NeuN(1:1000, 항-NeuN 닭, Millipore, 독일) 및 Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP의 면역염색을 위한 100μm 두께의 관상 절편을 얻기 위해 진동 블레이드 vibratome(Leica, 독일)을 사용하여 뇌를 절단했습니다. (1:1000, 항-GFAP 토끼, Abcam, 영국).

NeuN 면역염색은 광혈전증 7일 후 뇌졸중 병변 부피를 정량화하기 위해 수행될 것이다. 각 동물의 스트로크 볼륨은 모든 손상된 영역을 합산하고 숫자에 섹션 두께와 4(간격 계수)를 곱하여 계산됩니다. 이미지는 (Stemi 508, Carl Zeiss)로 획득됩니다. 총 부피(mm3)는 분석된 모든 동물의 평균 ± 표준 오차로 제공됩니다.

GFAP(Glial Fibrillary Acid Protein) 양성 뉴런의 수는 Nikon Plan EPO 60X 대물렌즈(NA 1.4, oil immersion Nikon, Tokyo, Japan)가 장착된 공초점 형광 현미경(Nikon Eclipse TE 300, Tokyo, Japan)을 사용하여 분석됩니다. 조사관은 4개의 관심 영역, 즉 경색 주변 영역(허혈성 경계 영역), 뇌졸중 코어에서 멀리 있는 동측 반구의 영역(동측 원격 영역), 경색 주변 영역과 반대측인 영역에 대한 조사에 집중할 것입니다. (반대측 허혈 경계 영역), 및 허혈성 코어에 반대측인 건강한 반구의 영역(대측성 허혈성 코어).