Akutní ischemická CMP: Z LAboratoře na lůžko pacienta (STROKELABED)

Účelem projektu je vyhodnotit korelaci cirkulujících biomarkerů souvisejících s narušením hematoencefalické bariéry s rozvojem mozkového edému, hemoragickou transformací a rozšířením ischemické oblasti vyšetřované moderními neurozobrazovacími technikami za účelem identifikace prediktorů reperfuzního poškození v pacientů podstupujících revaskularizační terapii.

Souběžně s klinickou studií budou výzkumníci zkoumat mechanické aspekty korelace mezi neuronální degenerací a změnou vaskulární permeability. Za tímto účelem vědci použijí kombinaci pokročilých mikroskopických technik a životně důležitých fluorescenčních značek v novém myším modelu ischemické mrtvice.

- Klinické prostředí: Jedná se o monocentrickou retrospektivní observační studii pacientů s akutní ischemickou cévní mozkovou příhodou, kteří podstoupili revaskularizační terapie (systémová trombolýza, endovaskulární léčba) na Iktové jednotce FN Careggi od 1. října 2015 do 31. května 2020. Údaje o pacientech budou zapsány do vyhrazeného registru: demografické a klinické údaje a také hematochemické a neurozobrazovací parametry zahrnuté v této studii. Do analýzy budou zahrnuty dostupné cirkulující biomarkery a neurozobrazení odebrané při příjezdu do nemocnice a opakované 24 hodin po intervencích, stejně jako klinický/funkční výsledek hodnocený 3 měsíce po cévní mozkové příhodě podle upravené Rankinovy ​​škály návštěvou nebo telefonickým rozhovorem.

Laboratorní protokol:

V naší fakultní nemocnici se pacientům s akutní ischemickou cévní mozkovou příhodou běžně odebírají vzorky krve před a 24 hodin po reperfuzní léčbě (buď intravenózní trombolýza nebo endovaskulární trombektomie). Vyšetřovatelé mohli získat vzorky krve již použité pro předchozí studii (Piccardi et al. 2018) a stále správně uložené a dostupné v naší biologické bance: krev se odebírá do zkumavek jak s antikoagulantem, tak bez antikoagulantu. Zkumavky se poté odstřeďují při teplotě místnosti při 1500 x g po dobu 15 minut a supernatant se skladuje v alikvotech při -80 °C.

Neurozobrazovací protokol:

Základní neurozobrazovací vyšetření, včetně nekontrastní CT (NCCT), CT-angiografie (CTA) a CT-perfuze (CTP), bylo provedeno před akutními intervencemi, pokud je to indikováno podle pokynů platných v době léčby. U všech pacientů bylo provedeno 24hodinové sledování NCCT.

Po 24 hodinách, podle mezinárodních směrnic, všichni pacienti podstoupí kontrolní CT hlavy nebo MRI mozku ke stanovení přítomnosti hemoragické transformace, mozkového edému a objemu ischemické oblasti. Opětovné načtení již pořízených snímků bude provedeno ve formátu DICOM. Shromážděné údaje budou evidovány ve zvláštní části elektronického registru.

Dva odborní neurologové samostatně vyhodnotí výchozí a 24hodinové CT každého pacienta a zaznamenají přítomnost mozkového edému klasifikovaného podle kritérií SITS-ISTR: COED1 = fokální otok mozku do jedné třetiny hemisféry, COED2 = fokální otok mozku větší než jedna třetina hemisféry, COED3 = otok mozku s posunem střední čáry, ŽÁDNÁ = nepřítomnost mozkového edému. Dva nezávislí neurologové také vytvoří manuální mapování („masku“) ischemické léze viditelné na 24hodinovém CT vyšetření. Případné nesrovnalosti vyřeší zkušený neuroradiolog. Pro tento proces bude použit FSLeyes, software zahrnutý v softwaru FSL (FMRIB Software Library v6.0, Created by Analysis Group, FMRIB, Oxford, UK), který nabízí možnost generovat trojrozměrnou masku lézí pro každý pacienta, pokrývající infarktovou tkáň na všech CT řezech. Předchozí ischemické výsledky (již přítomné na výchozím CT) nebudou do masek zahrnuty.

Anatomické zkreslení (AD) bude hodnoceno porovnáním výchozího CT s 24hodinovým CT. Kroky potřebné k získání tohoto měření zahrnují vymezení ischemické léze viditelné za 24 hodin pomocí "masky" (popsané výše) a registraci, což je postup, který umožňuje přesně porovnávat různé obrazy mozku, dokonce i v různých časech a u jednotlivců. AD lze vypočítat porovnáním dvou možných registračních přístupů a zejména kvantifikací rozdílu mezi maskami lézí zpracovanými lineární a nelineární registrací podle metody popsané Harstonem et al. v roce 2018. Veškeré zpracování a analýza obrazu bude prováděna pomocí softwaru FSL (FMRIB Software Library v6.0, vytvořeno analytickou skupinou, FMRIB, Oxford, UK), volně přístupného softwaru vyvinutého výzkumnou skupinou Oxfordské univerzity.

3měsíční výsledek: Všichni pacienti léčení systémovou trombolýzou nebo endovaskulární léčbou jsou sledováni 3 měsíce po iktální příhodě s vyhodnocením klinicko-funkčního výsledku dle modifikované Rankinovy ​​škály, přímo v ambulanci nebo po telefonickém rozhovoru .

Tyto údaje je proto nutné získávat z ambulantních hlášení. Pouze v případě, že údaje chybí, bude proveden telefonický rozhovor.

- Preklinické nastavení: Skupina preklinického výzkumu bude charakterizovat nový myší model okluze/reperfuze MCA. Všechny postupy zahrnující myši budou prováděny v souladu s předpisy italského ministerstva zdravotnictví, povolení č. 723/2019.

Myši budou anestetizovány ketaminem (50 mg/kg) a xylazinem (9 mg/kg). Tělesná teplota bude udržována na 37 °C pomocí vyhřívací podložky. Myši budou umístěny na chirurgické podložce a budou ležet na jedné straně. Myší chloupky mezi okem a uchem budou odstraněny a poté bude kůže vyčištěna betadinem a etanolem. Poté bude aplikováno lokální anestetikum lidokain 2%. Kůže nad skvamózní kostí bude naříznuta čepelí, sval bude oddělen od lebky a jemně zatlačen dolů, aby se odhalila kost.

Poté bude pomocí zubní vrtačky (Silfradent, Italia) vytvořena malá kraniotomie k obnažení distální větve střední mozkové tepny. Po odstranění lalokové kosti bude intraperitoneálně injikováno fotosenzitivní barvivo Rosebengal (0,2 ml, 10 mg/ml roztok ve fyziologickém roztoku; Sigma Aldrich, USA). Pět minut po injekci bude 532 nm laser (Laser Diode CPS532, Thorlabs, Německo) zaostřen před větvením MCA po dobu 25 minut, aby se vyvolala tvorba stabilní sraženiny. Třicet minut po okluzi distální větve MCA, aby se podpořilo narušení sraženiny a následná rekanalizace krevní cévy, vyšetřovatelé osvětlí stejnou oblast 365 nm UV LED (High-Power LED SOLIS -365C, Thorlabs, Německo) po dobu patnácti minut. Po období UV ozařování se distální větev výsledku MCA rekanalizovala. Na konci procedury bude sval nahrazen přes kost a kůže sešita.

Během experimentálního časového okna budou vyšetřovatelé charakterizovat funkční poškození vyvolané okluzí distální větve MCA s rekanalizací a bez ní.

K tomuto cíli využijí vyšetřovatelé skóre neurodeficitu modifikující protokol aplikovaný Balbim a jeho spolupracovníky v roce 2019, na základě standardizovaného kvalitativního hodnocení pro měření stupně motorického postižení (Bederson et al. 1986) za použití panelu pěti motorických testů k hodnocení. síla, rovnováha a schopnost addukce a flexe.

V podskupině myší budou vyšetřovatelé zkoumat objevení se změn hematoencefalické bariéry 24 hodin po distální okluzi MCA.

Za tímto účelem výzkumníci vstříknou do ocasní žíly myši 0,20 ml barviva Evansova modř (0,20 mg/ml) na konci operace k uzavření distální větve MCA. 24 hodin po injekci bude zvíře anestetizováno předávkováním ketaminem (50 mg/kg) a xylazinem (9 mg/kg) a poté perfundováno 100 ml PBS, aby se odstranila krev z mozkové tkáně. Mozek bude poté extrahován a inkubován v PFA 4% po dobu jedné hodiny. Potom bude mozek rozřezán mozkovou matricí produkující přibližně 15 plátků o tloušťce 1 mm.

V další podskupině myší budou výzkumníci charakterizovat rozšíření lézí a nábor astrocytů 7 dní po indukci mrtvice.

Za tímto účelem budou zvířata anestetizována předávkováním ketaminem (50 mg/kg) a xylazinem (9 mg/kg) a poté transkardiálně perfundována 4% paraformaldehydem. Mozky byly řezány pomocí vibratomu s vibrační čepelí (Leica, Německo), aby se získaly 100 um tlusté koronální řezy pro imunobarvení Neuronal marker, NeuN (1:1000, anti-NeuN kuře, Millipore, Německo) a Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP (1:1000, králík anti-GFAP, Abcam, Spojené království).

Imunologické barvení NeuN bude provedeno pro kvantifikaci objemu mrtvicových lézí 7 dní po fototrombóze. Objem úderů pro každé zvíře se vypočítá sečtením všech poškozených oblastí a vynásobením čísla tloušťkou řezu a 4 (faktor vzdálenosti). Snímky budou pořízeny pomocí (Stemi 508, Carl Zeiss). Celkový objem v mm3 bude uveden jako průměr ± standardní chyba všech analyzovaných zvířat.

Počet neuronů pozitivních na gliální vláknitý protein (GFAP) bude analyzován pomocí konfokálního fluorescenčního mikroskopu (Nikon Eclipse TE 300, Tokio, Japonsko) s objektivem Nikon Plan EPO 60X (NA 1.4, olejová imerze Nikon, Tokio, Japonsko). Vyšetřovatelé zaměří naše vyšetřování na 4 oblasti zájmu, tj. periinfarktovou oblast (ischemická hraniční zóna), oblast na ipsilezionální hemisféře vzdálenou od jádra iktu (ipsilezionální vzdálená zóna), oblast kontralaterální k periinfarktové oblasti. (kontralaterální ischemická hraniční zóna) a oblast na zdravé hemisféře kontralaterálně k ischemickému jádru (kontralaterální ischemické jádro).